| 研究課題/領域番号 |
26293291
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
小池 直人 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員教授 (50301081)
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| 研究分担者 |
谷口 英樹 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70292555)
武部 貴則 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (20612625)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 再生医学 / 移植・再生医療 / 微小血管網 / 高次肝組織 |
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| 研究実績の概要 |
Retrovirus vectorでenhanced green fluorescence protein (EGFP)やKusabira Orange(KO)等を導入し可視化できるようにしたヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)、ヒト骨髄由来間葉系細胞(hMSC)、hiPS細胞から作製した肝前駆細胞hiPS-Hepを共培養し、in vitroで肝芽を作製した。この肝芽をクラニアルウインドウ内に移植し、生体蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡で経時的に観察した。その結果、EGFP-hiPS-Hepは急速に増殖し、互いに接着し、1個1個の細胞を識別できなくなった。同時にHUVECは血管網をこの中で形成し、ローダミンデキストランをトレーサーとして静注すると、HUVECからなる微小血管網内に宿主から流れ込んだ血液が観察できた。レーザー顕微鏡下で経時的に観察することにより、宿主血管と高次肝組織内のHUVECから構築された血管との連結過程が観察可能となった。
次に、hiPSより文献情報を基にCD31陽性の血管内皮細胞の分化誘導を試みた。するとCD31陽性細胞の出現は確認できるものの、文献で報告されているものに較べ、CD31陽性率は極めて低いことが明らかとなった。このため、播種細胞密度などを検討しながら複数回試行したがCD31陽性細胞数は低かった。得られた細胞についていくつかの血管内皮細胞マーカーの発現を検討したところ発現が確認された。今後肝芽形成に充分な量の血管内皮細胞の分化誘導を得るために、他の文献情報なども参考にしつつ、プロトコルの改良を試みる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では最終的に動静脈や、門脈、胆汁分泌が可能な胆管構造を有するヒト型高次肝組織の構築を目指している。そのために、Nature誌で発表した肝組織の基となる肝芽のソースとしてiPS-Hepを用いるのみならず、血管内皮細胞もiPS細胞より誘導することを目指している。そこでまず、ヒトiPS細胞から内皮細胞を誘導することを試みた。検討の結果、報告されているいくつかの血管内皮細胞の分化誘導法では効率よく、増殖性が高い血管内皮細胞を分化誘導することが困難であることが明らかとなった。これを改善するためには、論文に記載されていない細かな諸条件などを最適化する必要があること、ヒトiPS細胞のクローンを変更すること、未分化細胞の維持培養方法を検討することなどが考えられ、肝芽形成実験に利用するためには今後、安定的に分化誘導可能な改良法の確立が必須であることが明らかとなった。このことから、ヒト型高次肝組織の構築に必須なヒトiPS細胞由来血管内皮細胞の分化誘導法の確立に取り組んでおり、ヒト型高次肝組織の構築の達成へ向けた課題が明らかとなり、順調な進捗であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
動静脈や、門脈、胆汁分泌が可能な胆管構造を有するヒト型高次肝組織の構築を目指す為に、予定通りiPS細胞より内皮細胞の誘導構築を達成する。特に、本年度に明らかとなったiPS細胞からの内皮細胞の分化誘導プロトコルにおける課題解決を目指し、クローンの変更、細かな諸条件の検討、他の文献のプロトコルの検討などを実施する。さらにヒトの再生医療への利用を目指すため、改良したプロトコルを基盤に肝芽形成実験を行う。その後、肝芽を移植実験に利用することで、従来のHUVECを用いる方法とタンパク質合成機能などの肝機能の評価を行う。また、最終的には間葉系細胞もiPS細胞より誘導し、ALL iPSのヒト型高次肝組織構築視野に入れている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年度はヒトiPS細胞を用いて血管内皮細胞を分化誘導する方法の確立を中心に検討を行った。このため比較的費用がかからないin vitroでの実験に注力したため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
in vitroでヒトiPS細胞からの血管内皮細胞への分化誘導法をさらに複数検討するためにサイトカインや抗体を新たに購入費する。さらに免疫不全マウスを用いたin vivo移植実験計画しており、移植実験に必要なマウスの他、in vivoで可視化するための抗体や蛍光試薬等の必要物品の購入に使用することを計画している。
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