| 研究課題/領域番号 |
26293298
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
松原 久裕 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20282486)
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| 研究分担者 |
井ノ上 逸朗 国立遺伝学研究所, 人類遺伝研究部門, 教授 (00192500)
阿久津 泰典 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00375677)
田村 裕 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50263174)
村上 健太郎 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (40436382)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 食道癌 / 全ゲノムシーケンス / がん抑制遺伝子 / 遺伝子変異 / 発現制御 |
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| 研究実績の概要 |
平成２５年１月から平成２６年３月までに千葉大学附属病院を受診した扁平上皮癌患者２１名について腫瘍の生検サンプルを、４名について手術標本より腫瘍部および正常食道組織をそれぞれ採取し、その腫瘍と食道正常組織それぞれからDNAとRNAを抽出した。すべての症例において末梢血液も採取し、コントロールとして用いるDNAを抽出した。
DNAについては全エキソン領域および調節領域を含むDNAライブラリーを作成し、RNAについてはpoly A tailを有するmRNAを選択しcDNAの合成を行った。DNAおよびRNAのライブラリーについて次世代シークエンサーIllumina HiSeq2500によるシーケンスを行った。
DNAの解析では２５検体において3千以上の点突然変異および欠失・挿入変異が認められ、うち約7割以上の変異はアミノ酸置換あるいは終止・開始コドンへの置換を伴う変異であった。現在まで食道扁平上皮癌ではTP53遺伝子をはじめとする遺伝子変異に関する報告があるが、今回の解析においてもTP53の変異が8割以上と最多であり、上皮の分化に関係する遺伝子が約2割と次いで多く認められた。
TP53変異とRNAの発現を比較すると、スプライシング領域や終止コドンへの変異ではTP53タンパクに発現低下が認められ、アミノ酸置換を伴う変異においては発現が維持されていることがわかった。アミノ酸置換を伴う変異の6割以上の症例においてDNAにおける変異アレルの割合に対してRNAにおける変異アレルの割合が有意に増加していることがわかった。同様の傾向がZNF750においても認められ、RNAでの変異アレル頻度が有意に増加していることが観察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定していた食道癌切除標本の全ゲノムシーケンス、食道癌切除標本および同一標本における正常食道粘膜から抽出したDNAそれぞれの全ゲノム配列を決定することに関しては25検体に関し終了し、ほぼ予定通り達成されている。
食道癌切除標本と正常食道粘膜における塩基配列の比較から、点変異、コピー数変化およびLOHなどの体細胞変異を検出し、癌特異的な変異を抽出することにより、、その結果3千以上の点突然変異および欠失・挿入変異が認められ、うち約7割以上の変異はアミノ酸置換あるいは終止・開始コドンへの置換を伴う変異を明らかにできた。また、TP53の変異が8割以上と最多であり、上皮の分化に関係する遺伝子が約2割と次いで多く認めらることが明らかになった。 一方、食道癌転移リンパ節のエクソームシーケンスにかんしては未だ、検索が進んでいない。臨床病理学的検索結果と今回、明らかにした変異を認めた遺伝子群に関し、癌の悪性度、治療の感受性、効果などとの関連に関しさらなる検討が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
食道癌切除標本の全ゲノムシーケンス、食道癌切除標本および同一標本における正常食道粘膜から抽出したDNAそれぞれの全ゲノム配列を決定にかんしては今後も継続する。
また、今年度結果のでていないリンパ節転移の全ゲノムシーケンスに関しては実験を推進する。
今回最も多く変異を認めたp5を中心に,p16, EGFR, Her2, K-Ras, Bcl-2, Bax等癌においてこれまで報告された重要な遺伝子群ならびに当科で食道の浸潤、転移に関与することを明らかにしてきたPrdx-1, Fra-1等の癌関連遺伝子および全ゲノムシーケンスおよびエクソームシーケンスから得られた新規癌関連遺伝子をパネル化し、多検体における大規模なスクリーニングを開始する。
また、食道癌切除標本、転移リンパ節および正常食道粘膜におけるCpGメチル化検出のためにバイサルファイトシーケンス、ヒストン修飾、クロマチン構造を明らかにするためにChIPシーケンスをおこなう。タンパク質のDNAへの結合と癌転移、浸潤の関連が予測される場合は対象タンパク質をターゲットとしたChIPシーケンスも必要に応じて追加する。バイサルファイト後のアライメントはBISMARK、ChIPシーケンスのピーク検出はMACSによる解析を開始する。
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