実用化を目指したヒトiPS細胞の軟骨分化誘導法の確立

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26293330
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 齋藤 琢 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (30456107)
• 研究分担者: 門野 夕峰 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (70401065) ; 矢野 文子 東京大学, 医学部附属病院, 特任助教 (80529040)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 再生医療 / 軟骨再生 / 変形性関節症

研究実績の概要

まず複数のhiPS細胞株を用いてサイトカインによる基礎検討を行った。初期胚からの中胚葉分化過程をWnt, BMP, FGFシグナルによって誘導し、その組み合わせとタイミングをスクリーニングした。さらに後半の軟骨分化過程をGDF5、FGF、インスリンシグナルを中心にその組み合わせとタイミングを検討を行った。その結果、Wnt3a、BMP4、FGF2、GDF5、インスリンを2週間にわたって順に使用することで良好な軟骨細胞マーカーの上昇を得ることに成功した。さらにこの分化した細胞がどの程度の軟骨組織形成能を有するかを確認するため、内径3mmのモールドに入れてディスクを形成し、それを免疫不全マウスの膝関節軟骨の大腿骨溝に作成した1mm径の欠損孔に移植した。8週間の経過で、iPS細胞由来軟骨細胞はサフラニンO強陽性の軟骨組織を形成したが、正常軟骨組織との境界には脱分化した組織が観察された。移植後8週間では腫瘍化は観察されなかったが、移植後16週間まで観察すると、6.7%の確率で腫瘍が発生した。組織学的に観察すると、腫瘍組織には外胚葉、中胚葉、内胚葉由来の組織が混在しており、テラトーマであることが判明した。このことから、未分化な細胞が残存したことが原因と考えられた。
また2014年度は、サイトカインではなく化合物だけでiPS細胞から軟骨細胞を誘導するための基礎検討も開始した。中胚葉分化については1-2種類の化合物で良好な結果を得た。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

サイトカインによる分化誘導については成績をまとめて現在投稿中である。化合物による分化誘導についても良好な成績を得つつあり、当初の計画以上の進展と考える。

今後の研究の推進方策

中胚葉分化誘導能、軟骨細胞分化誘導能を有する遺伝子や化合物のスクリーニングを行う。またこれらの作業と合わせ、これまでに絞り込んだ化合物によるiPS細胞からの軟骨細胞分化誘導法の最適化も平行して進める。分化誘導の評価は発現遺伝子のリアルタイムRT-PCR法、フローサイトメトリーで行い、さらに移植実験によって軟骨組織形成能、腫瘍形成のリスクについても検討し、将来の臨床応用の可能性を評価していく。

次年度使用額が生じた理由

サイトカインによる分化誘導について、当初の計画よりスムーズに進んだため、次年度以降の使用額に充当することができた。

次年度使用額の使用計画

ips細胞からの軟骨細胞分化誘導法に使用する試薬、消耗品

研究成果

• [雑誌論文] Transcription factor Hes1 modulates osteoarthritis development in cooperation with calcium/calmodulin-dependent protein kinase 2. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sugita S, Hosaka Y, Okada K, Mori D, Yano F, Kobahashi H, Taniguchi Y, Mori Y, Okuma T, Chang SH, Kawata M, Taketomi S, Chikuda H, Akiyama H, Kageyama R, Chung UI, Tanaka S, Kawaguchi H, Ohba S, Saito T
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A. 巻: 112 ページ: 3080-5
  • DOI: 10.1073/pnas.1419699112.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Individual and combining effects of anti-RANKL monoclonal antibody and teriparatide in ovariectomized mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tokuyama N, Hirose J, Omata Y, Yasui T, Izawa N, Matsumoto T, Masuda H, Ohmiya T,Yasuda H, Saito T, Kadono Y, Tanaka S
  • 雑誌名: Bone Reports. 巻: 2 ページ: 1-7
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Regulation of Mouse Chondrocyte Differentiation by CCAAT/Enhancer-binding Proteins. (2015)
  • 著者名/発表者名: Okuma T, Hirata M, Yano F, Mori D, Kawaguchi H, Chung UI, Tanaka S, Saito T
  • 雑誌名: Biomed Res 巻: 36 ページ: 21-9
  • DOI: 10.2220/biomedres.36.21.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Genome-wide comprehensive analysis reveals critical cooperation between Smad and c-Fos in RANKL-induced osteoclastogenesis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Omata Y, Yasui T, Hirose J, Izawa N, Imai Y, Matsumoto T, Masuda H, Tokuyama N, Nakamura S, Tsutsumi S, Yasuda H, Okamoto K, Takayanagi H, Hikita A, Imamura T, Matsuo K, Saito T, Kadono Y, Aburatani H, Tanaka S
  • 雑誌名: J Bone Miner Res. 巻: 未定 ページ: 未定
  • DOI: 10.1002/jbmr.2418.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of SCAN domain zinc-finger gene ZNF449 as a novel factor of chondrogenesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okada K, Fukai A, Mori D, Hosaka Y, Yano F, Chung UI, Kawaguchi H, Tanaka S, Ikeda T and Saito T
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e115169
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0115169.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] SOX10 Transactivates S100B to Suppress Schwann Cell Proliferation and to Promote Myelination. (2014)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara S, Hoshikawa S, Ueno T, Hirata M, Saito T, Ikeda T, Kawaguchi H, Nakamura K, Tanaka S, Ogata T
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e115400
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0115400.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Determination of differential gene expression profiles in superficial and deeper zones of mature rat articular cartilage using RNA sequencing of laser microdissected tissue specimens. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mori Y, Chung UI, Tanaka S, Saito T
  • 雑誌名: Biomed Res 巻: 35 ページ: 263-70
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] S100A1 and S100B are dispensable for endochondral ossification during skeletal development (2014)
  • 著者名/発表者名: Mori Y, Mori D, Chung UI, Tanaka S, Heierhorst J, Buchou T, Baudier J, Kawaguchi H, Saito T
  • 雑誌名: Biomed Res 巻: 35 ページ: 243-50
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Disease-modifying effects of TD-198946 on progressed osteoarthritis in a mouse model. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yano F, Ohba S, Hosaka Y, Saito T, Chung UI
  • 雑誌名: Ann Rheum Dis. 巻: 73 ページ: 2062-4
  • DOI: 10.1136/annrheumdis-2014-205672.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Stepwise Differentiation of Pluripotent Stem Cells into Osteoblasts Using Four Small Molecules under Serum-free and Feeder-free Conditions (2014)
  • 著者名/発表者名: Kanke K, Masaki H, Saito T, Komiyama Y, Hojo H, Nakauchi H, Lichtler AC, Takato T, Chung UI, Ohba S
  • 雑誌名: Stem Cell Reports. 巻: 2 ページ: 751-60
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2014.04.016.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of fibroblast growth factor-18 as a molecule to protect adult articular cartilage by gene expression profiling. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mori Y, Saito T, Chang SH, Kobayashi H, Ladel CH, Guehring H, Chung UI, Kawaguchi H
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 289 ページ: 10192-200
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.524090.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Positive feedback between NF-κB and TNF-α promotes leukemia-initiating cell capacity. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kagoya Y, Yoshimi A, Kataoka K, Nakagawa M, Kumano K, Arai S, Kobayashi H, Saito T, Iwakura Y, Kurokawa M
  • 雑誌名: J Clin Invest. 巻: 124 ページ: 528-42
  • DOI: 10.1172/JCI68101.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Establishment of Surgical Destabilization Model of Mouse Ankle Osteoarthritis (2015)
  • 著者名/発表者名: Chang SH, Saito T, et al.
  • 学会等名: Annual meeting of the Orthopaedic Research Society.
  • 発表場所: Las vegas, USA
  • 年月日: 2015-03-28 – 2015-03-31
• [学会発表] 軟骨内骨化研究から生まれる実用的研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 齋藤琢
  • 学会等名: 第29回日本整形外科学会基礎学術集会
  • 発表場所: 鹿児島
  • 年月日: 2014-10-10
  • 招待講演
• [学会発表] 変形性関節症への応用を目指した軟骨再生研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 齋藤琢
  • 学会等名: 第29回日本整形外科学会基礎学術集会
  • 発表場所: 鹿児島
  • 年月日: 2014-10-09
  • 招待講演
• [学会発表] HIF-1α IS ESSENTIAL FOR ARTICULAR CARTILAGE HOMEOSTASIS THROUGH INDUCTION OF ANABOLIC FACTORS AND SUPPRESSION OF CATABOLIC FACTORS. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okada K, Saito T, et al.
  • 学会等名: Annual meeting of the American Society for bone and mineral research.
  • 発表場所: Houston USA
  • 年月日: 2014-09-16
• [学会発表] Identification of Grem1 as a catabolic factor induced by mechanical stress loading in articular chondrocyte. (2014)
  • 著者名/発表者名: Chang SH, Saito T, et al.
  • 学会等名: Annual meeting of the American Society for bone and mineral research.
  • 発表場所: Houston USA
  • 年月日: 2014-09-15
• [学会発表] Expression and function of CCAAT/enhancer-binding protein family in chondrocytes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okuma T, Saito T, et al.
  • 学会等名: Annual meeting of the American Society for bone and mineral research.
  • 発表場所: Houston USA
  • 年月日: 2014-09-12
• [学会発表] 変形性関節症の制御メカニズムの解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 齋藤琢
  • 学会等名: 第32回日本骨代謝学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-07-25
  • 招待講演
• [学会発表] Research on pathophysiology and therapeutic target of osteoarthritis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Taku Saito
  • 学会等名: 16th Asia Pacific League of Associations for Rheumatology Congress (APLAR)
  • 発表場所: Cebu City, Philippines
  • 年月日: 2014-04-04
  • 招待講演
• [備考] 東京大学医学部整形外科
  • URL: http://www.u-tokyo-ortho.jp/