研究課題/領域番号 |
26293363
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研究機関 | 独立行政法人国立成育医療研究センター |
研究代表者 |
宮戸 健二 独立行政法人国立成育医療研究センター, 細胞医療研究部, 室長 (60324844)
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研究分担者 |
河野 菜摘子 独立行政法人国立成育医療研究センター, その他部局等, 研究員 (00451691)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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キーワード | 受精 / 卵 / 老化 / CD9 / エキソソーム / リン脂質 / 細胞毒性 / テトラスパニン |
研究実績の概要 |
精子は豊富に作り出され、運動能をもたず、自力では受精できない精子からでも顕微授精によって次世代を作ることができる。ただし、精子だけでは次世代を作ることは不可能であり、発生する能力を備えた卵が必要である。一方、卵は過排卵処理によっても得られる数が数十個と少なく、質が低下して受精能力や発生能力が極めて低くなった卵に対しては、若い卵から採取したミトコンドリアを含む細胞質成分を注入する方法が検討されているが、安全性や倫理面から多くの問題が指摘されている。そこで、卵の質が低下する根本的な原因を解明することが必要である。 今までの我々の研究成果として、膜4回貫通型タンパク質CD9が精子と卵の膜融合に必須であり、さらに、CD9を含む卵型エキソソームに含まれるリン脂質成分に融合促進活性があることを発見した。卵型エキソソームとは従来の細胞間の物質輸送に関わるエキソソーム(コンベンショナル型エキソソーム)とは構造が全く異なる。すなわち、卵型エキソソームでは明瞭な2重脂質層が形成されず、ナノサイズのユニットが集合した形態を呈している。ところがその後の研究から、我々が同定したリン脂質は純度が上がるほど分解されやすくなり、卵を破壊する細胞毒性因子としても作用することが明らかになった。また、リン脂質は細胞膜の成分として必須であり、体のどこの組織にも露出し、細胞毒性因子として作用する危険性がある。現に、様々な病態を呈した子宮内には、抗リン脂質抗体が存在することが知られている。そこで本研究では、受精の膜融合の研究から明らかになったタンパク質および脂質成分を手がかりにして、卵に対する細胞毒性物質の同定、細胞毒性作用の軽減、細胞毒性による卵の質の低下からの回復法を目指した研究を行う。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今までの我々の研究から、タンパク質成分を除いた脂溶性画分に膜融合活性が存在することが明らかになった。脂質成分を質量分析法によって詳細に解析したところ、リン脂質の中でも特に、ホスファチジルエタノールアミン(PE)の特定の分子種に膜融合促進活性があることがわかった。一般的に、この種のリン脂質は細胞膜の2重脂質層の内側の層に存在することから、卵型エキソソームは、このリン脂質を特異的に卵細胞膜から抽出し、精子細胞膜に移行させるために必要な構造体であることが推測された。また一方で、このリン脂質には強い細胞毒性があり、α-トコフェロールによってその細胞毒性が軽減されることも判明した。ただし、PEの卵に対する細胞毒性はα-トコフェロール単独では完全には除去することはできなかった。そこで、PEの酸化、還元、光分解、温度変化の視点から、PEの細胞毒性を抑制する物質の探索を行った。ガラスチューブ内で、クロロホルム中で安定なPEを乾燥させ、窒素を充填した後、分解される条件を検討した。その結果、-20℃、遮光以外のすべての条件で、PEが分解されてしまった。ただし、微量なクロロホルムが残存した場合は、どのような条件下でもPEが極めて安定であることがわかった。生体内にも-20℃、遮光保存、またはクロロホルムに対応する条件が存在するはずであり、何らかの物質の添加によって代替できるはずである。現在さらなる検討を行っている。卵における脂質研究は今まで行われてこなかったため、多くの困難な事態が予想されたが、現在までは概ね順調に進んでいる。
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今後の研究の推進方策 |
CD9を含めたテトラスパニンは脂質と親和性をもっていることが知られており、親和性を担っている構造として膜貫通領域の役割が考えられるが、詳細は不明である。また、テトラスパニンの4つの膜貫通領域のアミノ酸配列は高度に保存されており、CD9を介して卵型エキソソームが細胞外に形成されるように、細胞膜の内側に存在する脂質を細胞外に放出し、脂質の分解を防ぐとともに膜融合を促進させる機能を保つことにも機能している可能性が考えられる。そこで、CD9の4つの膜貫通領域のペプチドを合成し、PEに混合させることを検討している。さらに、コレステロールにもPEを保護する作用が推測されるため、PEに様々な濃度のコレステロールを添加することで、PEの保護条件についても検討する。また、卵型エキソソームを生体外で再構成することが重要であるとの考えから、野生型卵から採取した卵型エキソソームについて、超微形態学的に構造を明らかにする。
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次年度使用額が生じた理由 |
2015年4月に近距離での移動費が発生する可能性が生じたために、移動費として3,217円の繰り越し金額を設定した。
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次年度使用額の使用計画 |
近距離での移動費に充当する。移動費が発生しなかった場合には消耗品費として適切に使用する。
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