内耳におけるアクチン構造様式とその制御の包括的解析

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26293369
• 研究機関: 信州大学
• 研究代表者: 北尻 真一郎 信州大学, 医学部, 特任講師 (00532970)
• 研究分担者: 伊藤 壽一 京都大学, 医学研究科, 名誉教授 (90176339)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: アクチン / 不動毛 / 根 / 聴力

研究実績の概要

TRIOBP-4 (以下T4)とTRIOBP-5 (以下T5)を同時にKOしたマウス（T-4/5 KO）では根が全く発生せず、重度難聴であった。これに対してT5のみをKOしたマウス（以下T5 KO）では細いながらも根が存在し、やはり難聴であるがT-4/5 KOに比べて緩やかであった。今年度は、T4とT5の機能の違いをより詳細に解析した。
T4配列はT5の一部であるため、T4特異的抗体の作製は不可能である。そこでT4の局在を知るため、GFPタグ付きT4のトランスジェニックマウスを作製し、抗GFP抗体で染色した。するとT5の発現が根に限局しているのに対してT4は不動毛内にあるアクチン束の密度が高い部分（コア）にも発現していた。T5 KOの根は低形成であったが、通常のTEMでは切れる面によって像が異なり評価が困難であるため、三次元EMで評価する実験系を確立した。すると根は細く屈曲、枝分かれしているのに対して、コアは正常であった。つまりT4のみでコアは形成されること、根の発生にはT4が必要であるが、形態と聴力機能の維持にはT5が必要であることが示された。さらに、T-5 KOの低形成の根は剛性が下がっていることも直接的に計測した。
またT-4/5 KO蝸牛の器官培養へ遺伝子銃を用いての導入実験にてT5の根への局在にはT4が必要であること、HeLa細胞への導入実験にてT-5はオリゴマーを形成することが明らかになった。これはアイソフォーム間の協働を示している。
さらに、有毛細胞の不動毛の根だけでなく、支持細胞の突起にもT-4およびT-5が発現している。KOマウスではこの剛性が下がっていることが、Atomic Force Microscopy (AFM)を用いて示した。支持細胞の突起の機能はこれまで不明であったが、コルチ器全体の剛性を支えていることが初めて明らかにされた。

現在までの達成度 (段落)

29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

29年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] A novel splice site mutation of myosin VI in mice leads to stereociliary fusion caused by disruption of actin networks in the apical region of inner ear hair cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Seki Yuta、Miyasaka Yuki、Suzuki Sari、Wada Kenta、Yasuda Shumpei P.、Matsuoka Kunie、Ohshiba Yasuhiro、Endo Kentaro、Ishii Rie、Shitara Hiroshi、Kitajiri Shin-ichiro、Nakagata Naomi、Takebayashi Hirohide、Kikkawa Yoshiaki
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 12 ページ: e0183477
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0183477
  • 査読あり
• [学会発表] Making tool for analysis of TRIOBP function using induced pluripotent stem cells. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiroe Ohnishi、Shin-ichiro Kitajiri、Xiangxin Lou、Akiko Taura、Mirei Taniguchi、Fumi Ebisu、Tatsunori Sakamoto、Norio Yamamoto、Juichi Ito1、Koichi Omori、Takayuki Nakagawa
  • 学会等名: ARO The 41st Annual MidWinter Meeting
• [学会発表] Regulation of the localization of molecules in hair cell stereocilia by TRIOBP (2018)
  • 著者名/発表者名: Tomoko Kita, Raj K Ladher, Shin-ichi Usami, Shin-ichiro Kitajiri1
  • 学会等名: ARO The 41st Annual MidWinter Meeting
• [学会発表] TRIOBP5 Deficient Mouse is Deaf But Hair Cells Develop Stereocilia Rootlets (2017)
  • 著者名/発表者名: Inna A. Belyantseva, Tatsuya Katsuno, Gavin Riordan, Atteeq Rehman, Ayesha Imtiaz, Erich Boger, Eva Morozko, Joesh Duda, Elizabeth Wilson, Tracy Fitzgerald, Thomas B Friedman, Shin-ichiro Kitajiri
  • 学会等名: ARO The 40th Annual MidWinter Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Triobp Isoform Distribution Affects Stereocilia Rootlet Structure and Function (2017)
  • 著者名/発表者名: Tatsuya Katsuno; Inna A. Belyantseva; Makoto Ikeya; Kazuya Ono; Kohei Segawa Juichi Ito; Shin-ichiro Kitajiri; Thomas B. Friedman; Ronald Petralia; YaXian Wang
  • 学会等名: ARO The 40th Annual MidWinter Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Constitutive Activation of DIA1 (DIAPH1) via C-terminal Truncation Causes Human Sensorineural Hearing Loss (2017)
  • 著者名/発表者名: Yuzuru Ninoyu; Takushi Miyoshi; Hirofumi Sakaguchi; Naoki Watanabe; Shin-ichi Usami; Naoaki Saito; Shin- ichiro Kitajiri; Takehiko Ueyama
  • 学会等名: ARO The 40th Annual MidWinter Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] The functional analysis of DIAPH1, the responsible gene for DFNA1 (2017)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichiro KITAJIRI
  • 学会等名: International Congress of ORL-HNS 2017
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] DIA1変異マウスを用いたDFNA1の病態解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 二之湯弦, 北尻真一郎, 坂口博史, 宇佐美真一, 齋藤尚亮, 上山健彦
  • 学会等名: 第118回日本耳鼻咽喉科学会通常総会・学術講演
• [学会発表] Abnormal actin elongation activity of a novel hearing-loss Dia1 mutant revealed by single-molecule speckle microscopy (2017)
  • 著者名/発表者名: Takushi Miyoshi, Yuzuru Ninoyu, Naoki Watanabe, Shin-ichiro Kitajiri, and Takehiko Ueyama
  • 学会等名: 54th workshop on Inner Ear Biology and Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] The development and maintenance of hair cell stereocilia rootlets by isoform specific functions of TRIOBP (2017)
  • 著者名/発表者名: Tatsuya Katsuno, Inna A. Belyantseva, Ronald S. Petralia, Ya-Xian Wang, Keisuke Ohta, Kazuya Ono, Makoto Ikeya, Gavin P. Riordan, Joseph Duda, Elizabeth Wilson, Tracy Fitzgerald, Atteeq U. Rehman, Ayesha Imtiaz, Juichi Ito, Thomas B. Friedman, Shin-ichiro Kitajiri
  • 学会等名: 54th workshop on Inner Ear Biology and Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] An Attempt to Establish In Vitro Model Using TRIOBP KO Induced Pluripotent Stem Cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroe Ohnishi、Shin-ichiro Kitajiri、Xiangxin Lou、Akiko Taura、Mirei Taniguchi、Fumi Ebisu、Tatsunori Sakamoto、Norio Yamamoto、Juichi Ito1、Koichi Omori、Takayuki Nakagawa
  • 学会等名: 1st International Symposium on Inner Ear Therapies
  • 国際学会
• [学会発表] 遺伝性難聴DFNA1の原因遺伝子DIAPH1と、その変異による難聴発症メカニズムの解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 北尻真一郎、二之湯弦、西尾信哉、三好拓志、鳥居紘子、西村幸司、菅原一真、坂田英明、Dean Thumkeo、坂口博史、渡邊直樹、宇佐美真一、齋藤尚亮、上山健彦
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第62回大会
• [学会発表] 不動毛の「根」の低形成と難聴 (2017)
  • 著者名/発表者名: 北尻真一郎、伊藤壽一
  • 学会等名: 第27回日本耳科学会
• [学会発表] "内耳感覚毛の「根」の形成および維持における TRIOBPアイソフォームの役割" (2017)
  • 著者名/発表者名: Tatsuya Katsuno, Keisuke Ohta. Makoto Ikeya, Kazuya Ono, Koichi Omori, Juichi Ito, Shin-ichiro Kitajiri
  • 学会等名: 第40回日本分子生物学会年会