| 研究課題/領域番号 |
26293376
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
木下 茂 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30116024)
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| 研究分担者 |
羽室 淳爾 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80536095)
上野 盛夫 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40426531)
奥村 直毅 同志社大学, 公私立大学の部局等, 助教 (10581499)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 再生医療 / 角膜内皮細胞 / 細胞相転移 / 細胞外微粒子 / エキソゾーム / miRNA / メタボローム |
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| 研究実績の概要 |
研究主題は「角膜内皮細胞亜集団間コミュニケーションによる相転移制御の分子実態解明」である。培養ヒト角膜内皮細胞(cHCEC) が細胞亜集団から構成されるとの世界初の知見をもとに、亜集団間の細胞機能の差異と相互干渉をヒト病態の疑似モデルに外挿し、新たな角膜内皮移植医療創出に革新的な視座を提供する。今年度は、cHCECの相転移に係るエキソゾーム などの細胞外微粒子の分子動態と機能解析を中心に研究を展開した。同時に、長期臨床成績に優れる角膜内皮移植医療の新たな臨床評価技術を開拓するために角膜移植、DSAEK施術患者の前房水、血清などのサイトカインプロファイルの解析や角膜移植時の残りリムの培養によりどのような亜集団が主たる構成亜集団になるかの検討を実施した。今後、角膜移植の予後成績との対応付けに資する。
5つの達成目標について述べる。1.ドナー差によるエフェクター細胞の構成割合の解析については、年齢、角膜採取の時間的経過、全層角膜移植時の残りリムの培養により成熟分化内皮細胞の形質を有する細胞〔エフェクターと称する〕の割合がドナーによって異なることを確認し、全層角膜移植の長期予後成績と対応付ける基礎データを集積した。2. 亜集団の細胞形質と機能的変化の対応付けについては代謝産物の差異、サイトカイン、miR産生プロファイルについて解析が進み、細胞増殖特性、ミトコンドリア機能の解析も開始した。3. 亜集団間の細胞間相互作用については、選択miRのmimics、阻害剤の細胞内導入実験や分泌するエキソゾーム種類の差を同定できた。4. レシピエント側の前房内サイトカイン環境については、その多様性を明らかにし、SASPの視点だけでは解釈が不十分であることを明らかにした。５番目の長期臨床成績に優れる角膜内皮移植医療の臨床評価技術の解明については、4番目と1番目の成果を合わせて27年度以降具体化する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
角膜内皮幹細胞の拡大培養技術の開発については、1型コラーゲン3D ゲルを用いるsphere 培養による幹細胞様亜集団の拡大培養法（東医歯大中村哲也先生法）、また、無血清培地とラミニン5フラグメントE8を用いる培養法により、1ケ月4回継代で2x10^9迄細胞数を増やすことに成功したが、未分化な前駆細胞であることが判明し、分化方法を検討中である。
ドナー年齢の差に注目して、培養中の分化成熟エフェクター細胞・EMT 化形質細胞・幹細胞様増殖性細胞・老化形質細胞の生成割合を算出し、7-20才のドナーにおいて分化成熟エフェクター細胞が、2 才以下のドナーでEMT 化形質細胞が60 才以上で老化形質細胞の割合が多いことが判明した。上述のように培養でのエフェクター細胞比率と角膜移植の長期成績を対応させる方向で研究を実施した。
亜集団の細胞形質と機能的変化の対応付けについては表面抗原を指標にcHCEC を分別し対応付けを進めている。増殖特性、幹細胞様マーカー、ミトコンドリア含量などを解析している。細胞形質の可塑的性については未分化幹細胞様増殖細胞と成熟分化細胞の間に分化、脱分化双方向的可塑性のあることが判明した。
亜集団間の相互作用を担う分子実態の解明については、選別亜集団培養上清の交叉暴露により細胞形質の変換の可能性が確認されたのでその分子実態をエキソゾーム、もしくは、其処に含有される可溶性miRと想定し解析を進めている。分化細胞上清では低値を、相転移細胞上清では高値を示すmiR-X, miR-Zを同定した。相転移細胞からはCD9単陽性エキソゾームが選択的に産生されることを見出した。miR-Xの細胞内導入による成熟分化細胞機能誘導を確認した。また老化細胞亜集団でmiR146が減少することを検証した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ほぼ順調に進捗しているので計画書記載の方向で進める
分化成熟エフェクター細胞、幹細胞様増殖性細胞および休止期細胞の3 種が培養HCEC に亜集団として存在し、亜集団間に情報交換がなされ、SASP・miRNA・エキソゾームを介する亜集団間相互作用により動的可塑性が維持されることが示唆されつつあり、今後、報文化のためのデータ整備を行う。角膜ドナー差による亜集団構成割合の解析、亜集団の細胞形質と機能的変化の対応付け、ヒト角膜内皮細胞の培養における形質の均質性の評価技術の確立、亜集団間動的可塑性の人為的制御技術の開発、幹細胞様形質を有する亜集団の拡大培養法の確立、レシピエント側の前房内微小環境が移植角膜内皮細胞の相転移に及ぼす作用の解明などを計画書の予定に沿って着実に進める。これらの基礎知見を礎に、長期機能維持の可能な角膜内皮移植術の基盤技術を確立し、現在の角膜移植技術の根本的な革新を図る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画はほぼ順調に実施出来たが、現在の角膜移植技術の根本的な革新の早期実現を目指して加速度的に研究項目に取り組んできた。そのためそれぞれの研究項目については報文化に必要なデータは獲得できていない。26年度に獲得した基盤的成果を元に27年度に報分化を行うため、26年度は研究経費の見直しを繰り返し行い経費節減に務めたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
分化成熟エフェクター細胞、幹細胞様増殖性細胞および休止期細胞の3 種が培養ヒト角膜内皮細胞に亜集団として存在し、亜集団間に情報交換がなされ、SASP・miRNA・エキソゾームを介する亜集団間相互作用により動的可塑性が維持されることが示唆されつつあり、今後、報文化のためのデータ整備を行う。
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