| 研究課題/領域番号 |
26293397
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
井上 富雄 昭和大学, 歯学部, 教授 (70184760)
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| 研究分担者 |
中村 史朗 昭和大学, 歯学部, 講師 (60384187)
中山 希世美 昭和大学, 歯学部, 助教 (00433798)
望月 文子 昭和大学, 歯学部, 助教 (10453648)
鬼丸 洋 昭和大学, 医学部, 客員教授 (30177258)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 舌骨下筋群 / 呼吸 / 動脈灌流標本 / 高二酸化炭素血症 / セロトニン / 閉口筋運動ニューロン / NMDA受容体 |
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| 研究実績の概要 |
嚥下は延髄に存在する嚥下の中枢パターン形成機構（CPG）について、今年度は昨年度に行った除脳ラット灌流標本を用いた高CO2濃度負荷時の呼吸活動と舌骨下筋群の活動の関連性を調べる実験を継続するとともに、運動ニューロンの活動性の調節機構をスライス標本を用いて調べた。
生後3-4週齢のWistarラットを用いてイソフルレン麻酔下にて、横隔膜直下で下半身を離断し、上丘の前端で除脳を行い、下行大動脈の断端からカテーテルを挿入し、送液ポンプを用いて人工脳脊髄液を灌流し、除脳ラット灌流標本を作製した。高CO2濃度負荷を行うと頸神経、舌下神経、上喉頭神経および反回神経の活動が呼気相にも出現し、その中では反回神経の活動が一番遅れることが明らかとなった。また、高CO2濃度負荷によって呼息筋である肋間神経の活動が上昇し、その持続時間は、頸神経活動の持続時間と有意の正の相関があることが明らかとなった。
運動ニューロンの活動性の調節機構については、新生ラット脳幹スライス標本を用いて実験を行った。咬筋運動ニューロンからパッチクランプ記録を行い、スライス標本にケージドグルタミン酸を投与し、レーザー光を照射してグルタミン酸を局所的に解離して咬筋運動ニューロンの樹状突起に誘発されたグルタミン酸応答の、セロトニン（5-HT）投与による変調を解析した。5-HTあるいは5-HT2A受容体刺激薬を投与すると、グルタミン酸応答の振幅が増大し、5-HT2A/2C受容体拮抗薬で5-HTの増強効果は抑制された。5-HTによる増強効果は、NMDA型グルタミン酸受容体の拮抗薬投与で抑制されたが、AMPA型グルタミン酸受容体の拮抗薬の投与では抑制されなかった。以上の結果から、5-HTはMMN樹状突起上の5-HT2A受容体を介してNMDA型受容体の活性化に影響し、グルタミン酸性入力を増強することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究において正常動物に近い状態で機能する除脳ラット灌流標本の作製が必須である。本除脳ラット灌流標本の状態を評価するためには、すでに多くの報告がある呼吸の報告と比較することが最も確実な方法と言える。本年度は、昨年度に続いて除脳ラット灌流標本に適切な状態で呼吸が誘発されているかについて二酸化炭素濃度を上げた時の変化などを指標に評価を行い、CO2濃度上昇により、呼吸頻度の低下および舌骨下筋群の活動が呼息相から出現するとともに活動量が上がるという学術的に価値ある知見が得られるとともに、適切な状態で機能する除脳ラット灌流標本の開発に成功した。その成果をPLOS ONE誌に投稿し、現在、修正中である。
嚥下の実験モデルの開発が遅れているため、嚥下のパターン形成機構を先取りして解析する意味で、閉口筋活動の変調メカニズムを脳幹スライス標本によって解析した。その結果、セロトニンが5-HT2A受容体を介してNMDA受容体の活性を増大させ、閉口筋運動ニューロンの樹状突起のグルタミン酸応答を増強していることが明らかとなった。現在、免疫電顕を用いて樹状突起上のNMDA受容体と5-HT2A受容体の分布を検索するとともに、5-HT2A受容体を介するNMDA受容体のキネティックスを変調させる細胞内機構を検索中である。したがって本研究課題はおおむね順調に進展していると評価できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度は、平成27年度までに確立した除脳ラット灌流標本作成法をもとに、嚥下の動物実験モデルを確立する。さらに、嚥下のCPGの一部とされ、嚥下の開始やパターンを形成すると考えられている孤束核全体の神経活動を、光学的膜電位計測法やパッチクランプ法を用いて記録し、嚥下誘発時の嚥下関連筋の運動神経の活動パターンと合わせて解析を行う。また、閉口筋運動ニューロンのグルタミン酸応答についても引き続き実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度は、EM-CCDカメラの購入を予定していたが、レーザー顕微鏡のレーザー光源が故障したためこれを購入し、EM-CCDカメラについては別経費で購入した現有設備をあてることとした。レーザー光源の価格はEM-CCDカメラの購入予定額よりも低かったためなどの理由によって次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当初に計画された消耗品費および旅費等の他に、現有設備のスライス標本作成装置が故障したため、新たな機器（2,592,000円： Campden Instruments社製 VIBRATING MICROTOMES 7000smz-2）を購入する予定である。
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