研究課題/領域番号 |
26293419
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研究機関 | 東京医科歯科大学 |
研究代表者 |
池田 正明 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (20193211)
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研究分担者 |
池田 やよい 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (00202903)
大谷 清 関西学院大学, 理工学部, 教授 (30201974)
春日井 昇平 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (70161049)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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キーワード | 間葉系幹細胞 / 繊維芽細胞 / 骨 / 軟骨 / 培養 / 再生医療 / 分化転換 / リプログラミング |
研究実績の概要 |
本研究は、皮膚・口腔粘膜等から容易に培養できる線維芽細胞を効率的に骨・軟骨細胞に直接分化転換することにより、将来の新しい硬組織再生療法の開発に貢献することを目指している。そこで、本研究は、(1)ヒト線維芽細胞を短期間にかつ効率的に骨・軟骨・脂肪細胞へ直接分化転換することのできる培養系、(2)分化転換により得られた細胞の生体内での硬組織形成能・造腫瘍能、(3)脱分化して得られた多能性幹細胞の長期継代培養法を検討することを目的する。 既に、小分子化合物・増殖因子のスクリーニングをおこなった結果、ヒト繊維芽細胞を骨・脂肪細胞に直接分化転換する可能性のある分子の組み合わせを見出しており、現在、骨・軟骨細胞への分化転換効率を上昇させるための培養条件の詳細な検討をおこなっている。 一方、間葉系幹細胞など多能性をもつ成体幹細胞は、骨や軟骨に分化する能力をもち、再生医療において、有望な細胞の供給源の一つと考えられている。分化転換効率を上昇させるため、ヒト線維芽細胞から直接、骨・軟骨細胞へ分化転換するのではなく、多能性幹細胞へ分化転換する試みをおこなった。しかしながら、間葉系幹細胞は、増殖能力が低く、高齢者からは充分な量を確保できない等の問題があり、臨床応用を進める上での大きな障害になっている。 そこで、間葉系幹細胞の長期継代培養法を確立するため、多分化能をもつ成体幹細胞である骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を用いて検討をおこなった。種々の増殖因子や小分子化合物をスクリーニングした結果、高い多分化能を保ったヒト骨髄由来MSCを大量に長期間in vitro で培養することのできる成長因子および小分子化合物の組み合わせを見出した。その条件下でMSCは、継代数12回、約40回細胞分裂した。さらにこの方法は、60歳以上の高齢者から採取したMSCの大量培養にも有効であった。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、皮膚・口腔粘膜等から容易に培養できる線維芽細胞を効率的に骨・軟骨細胞に直接分化転換することである。幹細胞化を阻害する遺伝子の発現抑制、および幹細胞化を促進・維持する小分子化合物・増殖因子のスクリーニングをおこなった結果、ヒト繊維芽細胞を骨・脂肪細胞に直接分化転換する可能性のある分子の組み合わせを見出した。 以上に加えて、本研究では、脱分化した細胞の幹細胞としての特徴を解析し、その長期継代培養法を検討することを目的としている。ヒト繊維芽細胞を骨・脂肪細胞に直接分化転換する方法を見出しても、骨・脂肪細胞に分化する能力をもつ細胞を大量に増やす方法がなければ、再生医療に応用することは難しい。しかしながら、骨や軟骨に分化する能力をもつ間葉系幹細胞を長期間in vitroで培養する方法は確立されていない。 間葉系幹細胞の長期継代培養法を確立するため、多分化能をもつ成体幹細胞である骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を用いて検討をおこなった。種々の増殖因子や小分子化合物をスクリーニングした結果、高い多分化能を保ったヒト骨髄由来MSCを大量に長期間in vitro で培養することのできる成長因子および小分子化合物の組み合わせを見出した。さらにこの方法は、60歳以上の高齢者から採取したMSCの大量培養にも有効であった。 これまで多くの研究者が、多分化能を保った間葉系幹細胞の長期間培養を試みて来たが、未だに成功してない。このことを考えると、間葉系幹細胞の長期間培養を可能にさせる本研究の成果は、間葉系幹細胞の臨床応用に向けて有用であるだけでなく、幹細胞の研究分野においても学術的価値が高いと考えられる。
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今後の研究の推進方策 |
ヒト繊維芽細胞を骨・脂肪細胞に直接分化転換する可能性のある分子の組み合わせを見出しているが、骨・軟骨細胞への分化転換効率を上昇させることが今後の課題であり、現在、培養条件の詳細な検討をおこなっている。 昨年度の研究で見出した間葉系幹細胞の長期継代培養法については、骨髄間葉系幹細胞に加えて、脂肪幹細胞を用いた検討をおこなう。脂肪幹細胞は骨髄系幹細胞より、容易にかつ大量に採取することが可能であり、骨、軟骨、脂肪細胞に分化する能力をもつことが報告されているが、骨髄系幹細胞と同様、高い多分化能を保ったまま大量に増やすことが困難である。そこで、ヒト脂肪幹細胞について、分化多能性を維持した長期培養が可能であるかどうかを検討する。間葉系幹細胞の数が少ない高齢者から採取された骨髄間葉系幹細胞および脂肪幹細胞についても硬組織再生に必要な細胞を得られるかどうかを検討する。 得られた細胞について石灰化・軟骨・脂肪染色等により分化状態を評価するとともに、間葉系幹細胞の細胞表面マーカーおよび分化マーカーの発現について解析をおこなう。さらに生体内での硬組織形成能および造腫瘍性の有無を評価するため、培養担体とともに免疫不全マウスに移植する。4~8週間後に硬組織形成能および造腫瘍能を解析する。 線維芽細胞から骨・軟骨・脂肪細胞に分化転換される過程には、エピジェネティックな制御が関わっていると考えられている。そこで、骨・軟骨・脂肪細胞分化に重要な遺伝子のプロモーター領域におけるにDNAメチル化およびヒストン修飾等の解析を、それぞれバイサルファイト法およびクロマチン免疫沈降法により解析する。
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次年度使用額が生じた理由 |
今年度末に、人件費および実験動物の購入・飼育など研究に必要な予算を確保しておいた。しかしながら、実際にかかった費用が、予想より少なかったため次年度使用額が生じた。
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次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額については、翌年度分として請求した研究費と合わせて実験動物の購入・飼育等、研究の遂行に必要な用途に使用する予定である。
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