| 研究課題/領域番号 |
26293422
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| 研究機関 | 独立行政法人国立長寿医療研究センター |
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研究代表者 |
中島 美砂子 独立行政法人国立長寿医療研究センター, 幹細胞再生医療研究部, 部長 (20207773)
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| 研究分担者 |
兼子 智 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (40214457)
山本 徳則 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20182636)
栗田 賢一 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (40133483)
村上 真史 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 幹細胞再生医療研究部, 特任研究員 (30614531)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 歯髄幹細胞 / マルチガスインキュベータ / 微小重力培養 / 品質検査 / DNA傷害 |
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| 研究実績の概要 |
Single-Cell Pulsed-Field Gel Electrophoresis (SCPFGE)を歯髄幹細胞へ適応するための条件設定を行った。
細胞をシングルセルにする必要があることから、細胞の剥離方法について検討したが、トリプシンEDTAやトリプルセレクト等の酵素を使用する方法、スクレイパーにて物理的に細胞を剥離する方法のいずれでも、SCPFGEを行ったところ、非特異的なDNA損傷が見られた。そこで、末梢血リンパ球を使用してSCPFGEを実施した。
しかし、やはり非特異的なDNA損傷が見られた。その原因を探索したところ、サイトスピン標本を作製する際の細胞への物理的衝撃によって、細胞内小器官が損傷を受け、その結果生じる活性酸素によって、DNAが損傷されていることがわかった。さらに、サイトスピン標本作製時の細胞膜の損傷部位から、培養液中に含まれる成分が細胞内に取り込まれ、活性酸素が産生され、DNA損傷が生じていることが考えられた。
今後、活性酸素を主に産生する、ミトコンドリア電子伝達系の阻害剤等を添加することで、非特異的DNA損傷が抑制されるかどうかを検討する予定である。
歯髄幹細胞の最適培養法について、マルチガスインキュベータを使用して、酸素分圧を3%、6%にし、その際の培養液のpHをHepes Bufferにて安定させた上で培養し、通常条件下である21%酸素分圧下で培養した細胞と、幹細胞表面マーカー、遊走能、DNA安定性を調べている。さらに、微小重力環境下で、幹細胞の未分化性の維持や増殖能が上昇する報告から、微小重力培養装置を用いて培養し、通常重力環境下 (1G)で培養した歯髄幹細胞と幹細胞表面マーカー、遊走能を比較している。今後、さらにLot数を増やし、最適な条件を検討していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
SCPFGEを歯髄幹細胞で実施するための剥離方法が日常的に実施している方法では非特異的にDNAが損傷を受けていることがわかり、その点がまだ改善されていないため。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、歯髄幹細胞の最適培養法の探索を行う。マルチガスインキュベータ（エアーテック）を用いて、様々な酸素分圧下(3%、6%)にて培養する。また、昨年度にひき続き、微小重力培養装置（北川鉄工所）を用いて微小重力環境下で歯髄幹細胞を培養する。様々な酸素分圧下や微小重力下で培養した歯髄幹細胞と、従来の培養条件下（5%CO2、21%O2、1G）の歯髄幹細胞の細胞形態、幹細胞表面マーカー、遊走能、DNA安定性、各種遺伝子発現（幹細胞マーカー、血管新生因子、神経栄養因子）に違いが出るかどうかを検討する。
SCPFGEについては、活性酸素を主に産生するミトコンドリア電子伝達系の阻害剤の添加や、トレハロース等を用いて細胞膜を保護することで、非特異的なDNA損傷が見られなくなる条件を探索する。
さらに、フローサイトメーターを用いてソーティングや、Percollを使用した密度勾配遠心によって、老化して巨大化、扁平化した細胞を除去し、増殖性の高い、小さく厚みがある細胞のみを分取する方法を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
適正に使用した結果、端数が残った。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度に使用する資材、試薬等、消耗品の購入に使用する。
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