マラリア原虫アルテミシニン耐性遺伝マーカの開発:フィールドゲノミクスによる解析

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26305015
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 美田 敏宏 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80318013)
• 研究分担者: 大橋 順 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (80301141)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: マラリア / 薬剤耐性 / アルテミシニン / K13

研究実績の概要

（1）ウガンダ共和国における前年度までの調査で複数のin vitro RSAアルテミシニン耐性原虫を見出すことができた。これは調査地においてアルテミシニン耐性のポテンシャルを持った原虫が出現している可能性を示している。そこでin vivoレベルでの耐性出現を評価するため、アルテミシニン単独治療後の原虫密度を経時的にモニタリングした。その結果、解析が終了した約100例中3例においてWHOの耐性基準を越える原虫を発見した。アフリカで初のアルテミシニン耐性原虫の発見であり、現在データ固めをしている。
（2）（1）の調査において、原虫密度が0.1%を越える症例についてはRSAを実施、耐性例3齢中1例においてはRSAでも耐性基準を上回っていた。
（3）アルテミシニン耐性候補遺伝子PfKelch13のシークエンス解析により耐性3例すべてに特定の変異が確認された。本変異は昨年の調査では1例のみ見られており頻度が増加してきている可能性がある。本変異はアルテミシニン耐性関連変異と推定されているが、まだ確定されていない。
（4）ウガンダにおけるアルテミシニン耐性原虫の起源を明らかにするために、アルテミシニン耐性原虫3例および20例の感受性について、全ゲノム解析を実施、そのデータをもとに主成分分析およびSTRUCTURE解析を実施した。その結果、3例のアルテミシニン耐性原虫はいずれもアフリカ由来のマラリア原虫集団と強い相関を示したことから、アフリカで独自に出現したことが明らかになった。
（5）パプアニューギニアにおける集団遺伝学的解析によって、薬剤（サルファドキシン）耐性原虫の急激な増加によっても、原虫の集団多様性に変化は見られないことを明らかにした（Sci Rep 2018）。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

既存抗マラリア薬への耐性原虫の出現起源地であるパプアニューギニアとミャンマーに加え、ウガンダも調査地に加えることとなった。これは、本課題実施中にアフリカで初めての耐性原虫をウガンダで発見したためである。
その結果ウガンダ共和国において以下に示す多くの研究進捗が得られた。① in vivoレベルでのアルテミシニン耐性原虫が出現している可能性が示された。これはアフリカで初のアルテミシニン耐性原虫の発見であり、現在論文作成に向けデータ固めが進行中である。② ウガンダにおけるアルテミシニン耐性の遺伝マーカーとなりうる候補遺伝子変異をPfKelch13内に同定することができた。③ ウガンダで発見したアルテミシニン耐性原虫は東南アジアでの耐性原虫が移入したものではなく、アフリカで独自に出現したことを明らかにした。
これらの結果を踏まえ、本年度はウガンダでのフィールドで採取したマラリア原虫を凍結保存後、国内に持ち帰り、培養株樹立を実施する予定であった。患者からの培養株を用いることによって、RSAによる耐性レベルのconfirmation、網羅的な転写等による耐性メカニズムの解明、耐性遺伝子の同定を実施することが可能になる。しかし、凍結保存のために使用した携帯型ディープフリーザーが故障したため、解析に必要な数の培養株を樹立することができなかった。
パプアニューギニアでの調査にも大きな進捗がみられた。薬剤（サルファドキシン）耐性原虫の急激な増加によっても、原虫の集団多様性に変化は見られないことを明らかにしたほか、PfKelch13のC580Y変異が当地で出現していることを明らかにした。この変異は、メコン流域において急激に増加しており、アルテミシニン耐性の遺伝マーカーとしてWHOがその応用を推奨しているものである。

今後の研究の推進方策

次年度は最終年度の延長となる。以下2つの課題を進める予定である。
① ウガンダでの調査を実施し、アルテミシニン耐性出現のデータ固めをするとともに、凍結保存検体を得る。国内輸送後、培養株樹立を実施する。その後、RSAによる耐性レベルのconfirmation、網羅的な転写等による耐性メカニズムの解明、耐性遺伝子の同定、耐性遺伝マーカーの開発を実施する。
② パプアニューギニアでの調査で明らかになったPfKelch13のC580Y変異原虫について集団遺伝学的な解析を実施し、耐性の起源、拡散、可能であればアルテミシニン耐性へのバックグランド変異を解明する。

次年度使用額が生じた理由

本年度はウガンダでのフィールドで採取したマラリア原虫を凍結保存後、国内に持ち帰り、培養株樹立を実施する予定であった。しかし、凍結保存のために使用した携帯型ディープフリーザーが故障したため、解析に必要な数の培養株を樹立することができなかった。
次年度は、ウガンダでの調査を実施し、アルテミシニン耐性出現のデータ固めをするとともに、凍結保存検体を得る。国内輸送後、培養株樹立を実施する。その後、RSAによる耐性レベルのconfirmation、網羅的な転写等による耐性メカニズムの解明、耐性遺伝子の同定、耐性遺伝マーカーの開発を実施する。
また、新たにパプアニューギニアでの調査で明らかになったPfKelch13のC580Y変異原虫については、集団遺伝学的な解析を実施し、耐性の起源、拡散、可能であればアルテミシニン耐性へのバックグランド変異を解明する予定としている。このため、海外調査にかかる旅費と解析費用を予算として計上した。

研究成果

• [国際共同研究] オックスフォード大学(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: オックスフォード大学
• [国際共同研究] マヒドン大学(タイ)
  • 国名: タイ
  • 外国機関名: マヒドン大学
• [国際共同研究] グル大学/St.Mary Lacor病院(ウガンダ)
  • 国名: ウガンダ
  • 外国機関名: グル大学/St.Mary Lacor病院
• [国際共同研究] デバインワード大学(パプアニューギニア)
  • 国名: パプアニューギニア
  • 外国機関名: デバインワード大学
• [雑誌論文] 【今、蚊を考える-蚊媒介感染症に関する最近の話題】 蚊媒介感染症に関する最近の話題 マラリア (2017)
  • 著者名/発表者名: 美田敏宏
  • 雑誌名: 臨床と微生物 巻: マラリア ページ: 263-8
• [雑誌論文] Absence of in vivo selection for K13 mutations after artemether-lumefantrine treatment in Uganda. (2017)
  • 著者名/発表者名: Balikagala B, Mita T, Ikeda M, Sakurai M, Yatsushiro S, Takahashi N, Tachibana SI, Auma M, Ntege EH, Ito D, Takashima E, Palacpac NM, Egwang TG, Onen JO, Kataoka M, Kimura E, Horii T, Tsuboi T.
  • 雑誌名: Malar J. 巻: 16 ページ: 23
  • DOI: 10.1186/s12936-016-1663-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 原虫学・寄生虫学が現代のトップサイエンスにもたらす貢献 マラリアミューテーター マラリア原虫薬剤耐性進化解明の新たな研究ツール. (2017)
  • 著者名/発表者名: 平井誠, 池田美恵, 橘真一郎, 美田敏宏.
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会.
• [学会発表] 人類を助ける進化学研究：進化し続ける薬剤耐性マラリアの克服. (2017)
  • 著者名/発表者名: 美田敏宏
  • 学会等名: 公益信託 進化学振興木村資生基金 “微生物と人類の共存”をゲノムの視点から考える.
  • 招待講演
• [学会発表] End malaria-マラリアのeliminationをめざして アルテミシニン耐性の評価・検出ツールは出そろったか? 流行地でのフィールド調査から見えてきた問題点. (2017)
  • 著者名/発表者名: 美田敏宏
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会.
• [学会発表] ウガンダにおけるin vivo薬剤耐性試験およびRSAを用いたアルテミシニン耐性疫学調査. (2017)
  • 著者名/発表者名: 池田美恵, 橘真一郎, 山内祐人, Auma M, 関原誠, 森稔幸, 平井誠, Palacpac N, 木村英作, Aginya E, 堀井俊宏, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会.
• [学会発表] ウガンダ国の熱帯熱マラリア患者において腸内細菌叢の変化が起こる. (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷口委代, 宮内栄治, OliaAlex, 長安英治, OsbertKaturo, 鈴江一友, 今井孝, 下川周子, 大西里咲, I. O-A, PalacpacNirianne, 丸山治彦, 木村英作, 美田敏宏, 大野博司, 堀井俊宏, 久枝一.
  • 学会等名: グローバルヘルス合同大会プログラム・抄録集.
• [学会発表] ネズミマラリア原虫の有性生殖関連分子の機能解析. (2017)
  • 著者名/発表者名: 前多晟壮, 森稔幸, 平井誠, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会.
• [学会発表] マラリア原虫有性生殖の透視観察法の開発. (2017)
  • 著者名/発表者名: 森稔幸, 平井誠, 美田敏宏
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会.
• [学会発表] ウガンダにおける熱帯熱マラリア原虫キニーネ感受性の実態. (2017)
  • 著者名/発表者名: 山内祐人, 橘真一郎, 池田美恵, 関原誠, Balikagala B, 八代&櫻井美樹, 平井誠, Palacpac N, 木村英作, 堀井俊宏, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] 線虫ミトコンドリアのプロテオーム解析 二次元電気泳動法とショットガン質量分析. (2017)
  • 著者名/発表者名: 高宮信三郎, 數野彩子, 峯木礼子, 三浦芳樹, 美田敏宏.
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] Ascaris suum 成虫およびCaenorhabditis elegans ミトコンドリアのプロテオーム解析: 二次元ゲル電気泳動法とショットガン質量分析法. (2017)
  • 著者名/発表者名: 高宮信三郎, 数野彩子, 峯木礼子, 三浦芳樹, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] 宿主内競争による熱帯熱マラリア原虫のクロロキン感受性の回復. (2017)
  • 著者名/発表者名: 橘真一郎, 池田美恵, Balikagala B, 櫻井美樹, 八代聖基, 関原誠, 山内祐人, Auma MA, 平井誠, 森稔幸, Palacpac N, 片岡正俊, 木村英作, 堀井俊宏, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] Epidemiology of antimalarial drug resistance in Papua New Guinea. (2017)
  • 著者名/発表者名: 関原誠, 橘真一郎, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] Prerequisite Emergence of Background Mutations For Kelch13-Related Artemisinin-Resistant Plasmodium Falciparum Isolates. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tachibana S-I, Mori T, Hirai M, Mita T,
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Development of See-Through Imaging Methods for Sexual Reproduction of Malaria Parasites. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mori T, Hirai M, Mita T,
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Detection of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum isolates with ex-vivo ring-stage survival assay in Uganda. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mita T, Ikeda M, Kaneko M, Balikagala B, Tachibana S-I, Sakurai-Yatsushiro M, Yatsushiro S, Takahashi N, Hashimoto M, Katuro O, Olia A, Obwoya P, Auma M, Anywar D, Odongo-Aginya E, Hirai M, Palacpac N, Kataoka M, Tsuboi T, Kimura E, Horii T.
  • 学会等名: Keystone Symposia Conference: Malaria
  • 国際学会
• [学会発表] A mutator Plasmodium berghei model to investigate antimalarial drug resistance. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mita T,
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Pb102, A Novel Gene Essential for Female Fertility or Ookinete Maturation of Murine Malaria Parasite, Plasmodium Berghei. (2017)
  • 著者名/発表者名: Maeta A, Hirai M, Mori T, Mita T
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Application of a cell microarray chip system for accurate, highly sensitive, and rapid diagnosis for malaria. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kataoka M, Yatsushiro S, Yamamoto T, Oka H, Okello-Onen J, Odongo-Aginya E, Palacpac N, Mita T, Baba Y, Horii T.
  • 学会等名: Keystone Symposia Conference: Malaria:
  • 国際学会
• [学会発表] Isolation of Piperaquine Resistant Rodent Malaria Parasite from Mutator Malaria. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hirai M, Ikeda M, Tachibana S-I, Mita T,
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会