| 研究課題/領域番号 |
26340029
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| 研究機関 | 国際基督教大学 |
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研究代表者 |
布柴 達男 国際基督教大学, 教養学部, 教授 (10270802)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 高度好熱菌 / ゲノム情報維持 / 突然変異 / 相同組換え / 遺伝子発現 / レポーター / カロテノイド / シャトルベクター |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は、至適生息温度が70-80℃のグラム陰性細菌である高度好熱菌の,高温下でのゲノム情報維持機構を解明しようとするものである．平成26年度は、ゲノム不安定化の指標となるi) 突然変異頻度やそのスペクトルを解析する方法、ii) 相同組換え頻度を解析する方法、そしてゲノム安定化への寄与が考えられる遺伝子の発現をモニターするためのiii)遺伝子発現レポーターアッセイの樹立を目指した．
i)については、突然変異検出の標的遺伝子として大腸菌supFを採用し、大腸菌のベクターにsupFとともに高度好熱菌での薬剤マーカーとしてハイグロマイシン、複製可能にするためにrepAを挿入し、突然変異を解析するシャトルベクターpKAT925の構築に成功した．高度好熱菌でsupFに変異が固定したベクターは選択用大腸菌KS40/pOF105に導入後、ナリジキシン酸とストレプトマイシンに耐性を示すことが確認された．
ii)については、相同組換え（HR）の標的となるテトラサイクリン(Tc)抵抗性遺伝子を前半部分と後半部分がそれぞれ一部配列を重複するように順向きに挿入したシャトルベクターpMO11およびpMO12を樹立した．その重複部分で相同組換えがおこると、そのシャトルベクターをもつ大腸菌がテトラサイクリン抵抗性を示すことを確認した．
iii) カロテノイド合成の律速反応に関わるcrtB遺伝子をレポーターとするアッセイの樹立した．シャトルベクターにプロモーター領域を除したcrtBのORFをクローニングし，その上流にクローニングサイトを挿入したベクターpRA57を構築した．このベクターをcrtB欠損株に導入しても黄色を呈しないが、クローニングサイトに発現ベクターのプロモーターを挿入することで、黄色を呈した。さらにこのカロテノイド色素を108～109細胞からSDSやメタノール／クロロホルムにより抽出し、OD454により定量化出来ることも確認した.
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題の研究計画では、平成26年度は、至適生息温度が70-80℃のグラム陰性細菌である高度好熱菌の,高温下でのゲノム情報維持機構を解明するための独自のツールの樹立を目標にしてきた．事実、研究実績の概要にも記載したように、大腸菌supF遺伝子を標的とした突然変異頻度やそのスペクトルを解析するシャトルベクターpKAT925、大腸菌のtetA遺伝子上に挿入した相同する重複配列に生じた相同組換え頻度を解析するシャトルベクターpMO11およびpMO12、さらにゲノム安定化への寄与が推定される遺伝子の発現をモニターするための、カロテノイド色素合成遺伝子をレポーターベクターpRA57の作成に成功し、これらのアッセイの樹立が完了し、実験系が機能することを確認した．
平成27年度以降は、ゲノム情報維持機構を明らかにするため、エンドヌクレアーゼやグリコシラーゼなどのDNA修復欠損株を樹立した後、これらの実験系を用いて、エンドヌクレアーゼやグリコシラーゼなどのDNA修復機構の高温下でのゲノム情報維持への寄与を検討する予定である．
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度は、i) DNA修復酵素の欠損株の樹立とそれらの欠損株における突然変異頻度やスペクトル、相同組換え頻度の解析、ii)それらの修復遺伝子のプロモーター活性の測定、iii) 脱アミノ化ヌクレオチドに対する脱ピロリン酸酵素の候補遺伝子産物の生化学的解析を行う．
i) では、高温下でDNAやその前駆体であるヌクレオチドに生じる損傷として脱塩基や脱アミノ化、酸化などを想定し、脱塩基部位の修復に関わるAP endonuclease活性に着目してendonuclease IIIやendonuclease IV、酸化DNA損傷の代表である8-oxoGの修復酵素としてMutM glycosylase、脱アミノ化塩基損傷の修復系としてendonuclease Vなどのホモログ欠損株を樹立する．欠損株は、それらの遺伝子をPCRにより増幅してクローニングし、カナマイシンやハイグロマイシン耐性遺伝子htk、hph5などを挿入することで遺伝子破壊を行い、ゲノム上の遺伝子と組み換えることにより樹立する．それらの欠損株に平成26年度に樹立した突然変異検出系や相同組換え頻度検出系を導入し、頻度やスペクトルを解析する．
ii) では、i)で着目したDNA修復酵素遺伝子のプロモーター領域を遺伝子発現レポーターベクターpRA57にクローニングし、生成されたカロテノイド量をOD454により測定し、発現レベルを評価する．
iii)では、ゲノムデータベースから脱アミノ化ヌクレオチドに対する脱ピロリン酸酵素の候補遺伝子TTC1290に着目し，クローニングして遺伝子産物を精製し，活性を含む生化学的解析を行う．精製はGST-tagによるグルタチオンアフィニティーカラムにより行い，活性はdITPなどの脱アミノ化ヌクレオチドを基質としてHPLCにより３リン酸体と１リン酸体の定量により解析する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年度は備品として、テーブルトップ冷却遠心機およびサーマルサイクラーを購入したが、年度末になり、平成27年度に実施予定の脱アミノ化ヌクレオチドに対する脱ピロリン酸酵素の候補遺伝子TTC1290の遺伝子産物の精製および活性を含む生化学的解析に際し、細胞を効率よく破砕し、遺伝子産物を精製するための細胞破砕装置の購入が必要になったため、約80,000円を次年度使用にまわし、平成27年度の予算とあわせて、細胞破砕装置シェイクマンを購入する．
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| 次年度使用額の使用計画 |
物品費として701,212円を計上する。内訳は消耗品として生化学試薬、分子生物学試薬、一般化学試薬、ガラス器具、プラスチック製品などに601,212円、備品として細胞破砕装置シェイクマンを計上する．研究成果発表の学会出張旅費として120,000円を計上する．研究を遂行するための実験補助者に人件費200,000円を計上する．その他経費として、論文投稿料と論文校正費用として60,000円を計上する．
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