| 研究課題/領域番号 |
26340065
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| 研究機関 | 和歌山工業高等専門学校 |
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研究代表者 |
米光 裕 和歌山工業高等専門学校, 物質工学科, 教授 (20290778)
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| 研究分担者 |
岸本 昇 和歌山工業高等専門学校, 物質工学科, 教授 (50280433)
奥野 祥治 和歌山工業高等専門学校, 物質工学科, 准教授 (60458073)
土井 正光 和歌山工業高等専門学校, 物質工学科, 教授 (30217608)
楠部 真崇 和歌山工業高等専門学校, 物質工学科, 准教授 (40403761)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ホルムアルデヒド分解酵素遺伝子 / ホルムアルデヒド分解除去技術 |
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| 研究実績の概要 |
今年度の研究計画では、我々が先に分離したホルムアルデヒド（FA）分解菌Metylobacterium fujisawaense FD-1株からFA分解酵素遺伝子を単離し、大腸菌で発現させ、FA分解酵素を精製することを目的にした。まず大腸菌を宿主としたFD-1株ゲノムライブラリーを作製し、そこよりFA分解で生じるギ酸による酸性化をpH指示薬で検出するスクリーニング系によりFA分解活性株の選抜を試みたが、陽性株は得られなかった。そこで、FD-1株からFA分解酵素を精製し、そのアミノ酸配列情報をもとに遺伝子を単離することを試みた。そこでは、まずFD-1株菌体からタンパク質を抽出し、硫酸アンモニウム沈殿、疎水性クロマトグラフィー、SDS-PAGEによるFA分解酵素の分離操作を順次おこない、精製したタンパク質をnanoLC-MS/MS分析した。その結果、精製タンパク質はアルデヒドジスムターゼと示唆された。次に、nanoLC-MS/MS分析で得られたアミノ酸配列より推定される塩基配列より設計したDNAプライマーを用いて、FD-1株ゲノムDNAを鋳型としてPCRしたところ、既知アルデヒドジスムターゼ遺伝子と相同性の高いDNA断片（遺伝子の一部）が得られた。さらに、TAIL-PCRおよびPCRによりFA分解酵素遺伝子（全長鎖）を単離した。この遺伝子は既知アルデヒドジスムターゼ遺伝子と高い相同性を示したことからFAジスムターゼ遺伝子と判断した。この断片をpUC19ベクターに連結し、大腸菌DH5α株に導入したところ、形質転換大腸菌はFA分解活性を示した。これより、この大腸菌はFD-1株のFAジスムターゼを生産していると示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の研究計画は、ホルムアルデヒド（FA）分解菌Metylobacterium fujisawaense FD-1株からのFA分解酵素遺伝子の単離と大腸菌での発現およびその組換え大腸菌からのFA分解酵素の精製であった。今年度の研究実績は、上記「研究実績の概要」で述べた通り、当初の計画ではうまくいかなかったので途中より計画を変更し、FD-1株（野生株）からのFA分解酵素の精製してから、そのアミノ酸配列情報をもとにFA分解酵素（FAジスムターゼ）遺伝子を単離し、それを大腸菌で発現させ、FA分解活性を確認した。これより「おおむね順調に進展している」と判断した。ただし、今年度精製したFA分解酵素はFD-1株（野生株）由来なので、今後FA分解酵素（FAジスムターゼ）遺伝子をpUC19ベクターに連結した組換えプラスミドを保持した大腸菌から、またはpETベクターに連結した組換えプラスミドを構築し、それを導入した大腸菌からFAジスムターゼの精製を行う必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度は、FA分解酵素（FAジスムターゼ）遺伝子をpUC19に連結したプラスミドを保持した大腸菌から、またpETに連結したプラスミドを構築し、それを導入した組換え大腸菌から、それぞれカラム分離等により精製する。次いで精製したFAジスムターゼの反応機構を、FA分解反応生成物の詳細をHPLC/GC, MS等を用いて分析することより解明する。また、FAジスムターゼの反応速度論的解析（ミカエルス定数、基質阻害、生成物阻害）並びに反応特性（基質特性、至適温度・至適pH、温度安定性・pH安定性）等の特性を明らかにする。さらに、X線構造解析およびNMR分析によりFAジスムターゼの立体構造を明らかにする。一方で、固定化FAジスムターゼや固定化菌体によるFA分解技術の開発のために、それらに適した固定化法を検討する。
平成28年度（最終年度）はFAジスムターゼや菌体を用いた固定化酵素や固定化菌体による液相中並びに気相中のFA分解の至適条件を検討し、実用化に向けた基礎データを得る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度当初の研究計画どおりには進まなかったため、一部購入を予定していた試薬等を変更した。特にFA分解酵素遺伝子をpETベクターに連結する実験に至らず、それに必要な「大腸菌タンパク質発現及び精製キット（190千円計上）」を購入していない。また、学会発表に至らず、「国内旅費（46千円計上）」を使用しなかった。これらより次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
「大腸菌タンパク質発現及び精製キット（またはそれに準じたキット）」は平成２７年度購入する予定である。また、平成２７年度に学会発表する予定で、それに必要な国内旅費を使用する。
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