| 研究課題/領域番号 |
26340095
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| 研究機関 | 崇城大学 |
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研究代表者 |
千々岩 崇仁 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (30331060)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 生物多様性 / 適応 |
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| 研究実績の概要 |
・昨年度投稿を準備していた「Interisland variegation of venom [Lys49]phospholipase A2 isozyme genes in Protobothrops genus snakes in the southwestern islands of Japan (Toxicon. 2015; 107: 210-216)」が掲載された。
・ミトコンドリアDNAの塩基配列を比較して、沖縄島内で分布するハブの系統関係を明らかにした。「The taxonomic position and the unexpected divergence of the Habu viper, Protobothrorps among Japanese subtropical islands (Mol. Phylogenet. Evol. 2016, doi: 10.1016/j.ympev.2016.04.027. 」
・沖縄島北部（国頭）と南部（糸満）で捕獲したハブより、粗毒と毒腺を採取してきた。これまでに粗毒のゲル濾過と陽イオン交換クロマトグラフィーを行ったところ、陽イオン交換クロマトグラフィーでは中性領域のピーク組成が異なっていることがわかった。毒腺cDNAを解析したところ、糸満ハブにのみ中性[Asp49]PLA2のサブタイプが含まれることがわかり、この結果は毒クロマトグラフィーの結果とも符合する。今後は、中性領域のハブ毒PLA2アイソザイムの解析を中心に進めるとともに、毒腺cDNAの解析とゲノムDNAの構造解析をすすめていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
昨年度中にハブ粗毒のクロマトグラフィー解析と毒腺cDNAの解析を行ったところ、これまでにクサリヘビにはサブタイプが存在せず、強固に保存されているとされていた溶血性 中性[Asp49]PLA2アイソザイムのサブタイプを見出した。さらに、その結果と対応する毒タンパク質クロマトグラフィーも得られ、cDNAレベルのアーティファクトではないことも裏付けられた。さらに、浮腫誘導 塩基性[Asp49]PLA2アイソザイムも沖縄本島特有のものと、2013に沖縄属島である伊平屋島、久米島ハブから見出された新しいサブタイプの2種類が含まれることが示された。
捕獲がすすまない渡嘉敷島のハブは、今年度中に沖縄県衛生研究所と打ち合わせを行い、研究代表者自身で捕獲に赴くことを検討する。
また、宝島、小宝島、奄美大島、徳之島、沖縄、伊平屋島、久米島、石垣島、西表島、黒島、竹富島のハブ各数個体のミトコンドリアDNAの塩基配列を比較し、その生物学的距離と地質学的距離に相関があることを明らかにした（九州大学生体防御医学研究所・柴田弘紀准教授）。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度に沖縄島内でも北部（国頭）と南部（糸満）に棲息するハブでは、毒組成が異なることが明らかにした。特に中性域に含まれる、溶血性 中性[Asp49]PLA2アイソザイムに糸満特有の新規サブタイプが見出されたこと、浮腫誘導 塩基性[Asp49]PLA2アイソザイムには沖縄本島特有のものに加えて離島（伊平屋島、久米島）特有のサブタイプも含まれていたことは注目に値する。そこで平成28年度は、HPLCなどのさらなるクロマトグラフィーを行って、当該PLA2アイソザイムをハブ毒より単離・精製し、その全アミノ酸配列を決定することが中心課題となる（この作業は平成29年度まで持ち越す可能性が高い）。その上で、当該[Asp49]PLA2アイソザイムの分子生物学的背景を明らかとするため、毒腺cDNAおよびゲノムDNAの詳細な解析を行う（これは平成28年度中に解析完了を目途とする）。
得られた成果は28年末の分子生物学会で報告するとともに、平成29年度投稿を目途に論文にまとめる。
渡嘉敷島ハブは、島民による協力が難しいとのことだったので、沖縄県衛生研究所の協力のもと研究代表者自身で捕獲に行くことを検討している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度までに沖縄島北部（国頭）と南部（糸満）に棲息するハブ毒の組成が異なることが明らかとなった。平成28年度はこれら新しいサブタイプの精製とアミノ酸配列の決定を行うことになる。そのため、クロマトグラフィーとアミノ酸シークエンサーに用いる試薬・消耗品費用が必要となる。また、それぞれ固有の毒成分組成の分子生物学的背景を明らかとするため、毒腺cDNAおよびゲノムDNAの詳細な解析を行う必要があり、そのための試薬・消耗品費用が必要となる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ハブ毒タンパク質のHPLCなどのさらなるクロマトグラフィーに半年。その後のアミノ酸配列決定は酵素処理による断片化・分画も含めると半年から1年かかると予測される。
また、分子生物学的な解析は、平成27年度までに作成済みのcDNAライブラリーの解析を中心に進めるので1年以内に収束させる予定。
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