| 研究課題/領域番号 |
26340100
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
木村 哲哉 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (00281080)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | Clostridium / 水素ガス / セルロース / 共存培養 / 遺伝子破壊 / 乳酸デヒドロゲナーゼ |
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| 研究実績の概要 |
C. paraputrificum M21は水素ガスを高生産するが植物細胞壁を分解出来ない。そこで、植物細胞壁分解性の嫌気性細菌R. josuiと組み合わせて植物バイオマスから直接水素ガスを生産するため、本菌とR. josuiを、ボールミルセルロース1％を炭素源とするGS改変培地100mLで45℃にて10日間培養し、水上置換法でガスを回収した。本菌とR. josuiの共存培養ではR. josui単独に比べ最大で5.8倍の水素ガスを生産した。さらに、粉砕した稲わらを使って両株を共存培養したが、共存培養による水素ガス生産の増強ははっきりしなかった。次に、本菌の代謝を改変して水素ガス生産を増強する遺伝子の改変を行った。グルコースからピルビン酸を経てアセチルCoAに変換する経路において生じる還元力が水素生産に多く流れるように、まずピルビン酸から乳酸デヒドロゲナーゼによるNADHの消費を減らし、代謝の流れをアセチルCoAへ向けることで水素ガス生産の増強を考えて、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldh）の破壊を試みた。近年Clostridium属の遺伝子破壊に広く利用されているClosTronプラスミドpMTL007C-E2 (Nottingham Univ)を使って本菌の遺伝子破壊法を確立した。ベクターにリコンビナントPCRによって破壊用カセットを挿入し,本菌にエレクトロポレーションにより形質転換した。エリスロマイシン耐性によって遺伝子破壊株を選抜しldhが破壊されていることをPCR法で確認した。ldh破壊株を100mLのGS改変培地でグルコースを炭素源として嫌気培養瓶で培養した結果、乳酸がほとんど生産されなかった。本菌をジャーファメンターで500mLの培養にスケールアップし、培養条件を至適化したところ、グルコース1モルあたり1.8モルの水素ガスが生産された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
遺伝子破壊株の培養条件至適化を行っている途中で、ジャーファメンターが故障し、部品の調達等に時間がかかったため、実験を遂行に遅れが生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
共存培養による水素ガス生産については、ボールミル処理したセルロースの分解は順調であったが、より実用的な植物残渣を使った実験でははっきりとした効果が得られていない。一つの問題は、本菌がセルロースから生じるセロビオースやグルコースの資化能力は高いが、ヘミセルロースの分解から生じるキシロースなどの五炭糖の資化が遅い可能性がある。この資化に関する遺伝子をゲノム配列から解析し、何が原因か突き止める。
代謝工学による水素ガス生産の効率化については、Clostronによる遺伝子破壊方法のめどが立ったので、今後はさらに複数の遺伝子破壊を行い、代謝系を水素ガス生産に適したもとのなるように改変を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
培養措置（ジャーファメンター）が故障し、旧式のため部品の調達等に時間がかかったため修理が遅くなったため、培養条件の至適化等に遅れが生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
実験に使用する遺伝子改変をした菌株はすでにいくつかは完成しており、これらを用いて培養実験を順次行う。
上記でえられた結果をもとにして、複数の遺伝子改変を行った株について水素ガス生産の向上について陪乗条件を至適化を行う。
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