| 研究課題/領域番号 |
26350499
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
山本 由弥子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (20403496)
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| 研究分担者 |
松香 芳三 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (90243477)
小出 隆規 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (70322253)
丸濱 功太郎 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (60712792)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 細菌 / ボツリヌス神経毒素 / 疼痛抑制 / SNAP-25 |
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| 研究実績の概要 |
A型とE型ボツリヌス神経毒素（BoNT/A、BoNT/E）の疼痛抑制効果の分子機序を解明するために、H27年度は、前年度に引き続いて解析ツールの開発と作製を行うとともに、BoNT/AとBoNT/Eの三叉神経節での作用を解析した。
定量的で高感度なボツリヌス毒素活性測定法の開発：BoNT/E用のFRET基質について、検出感度を向上させるために、前年度に作製したペプチドデザインをもとにして、ペプチドの長さの最適化とFRETペア導入位置の最適化を図った。その結果、前年度に作製したペプチドよりも10倍以上検出感度を上昇させることに成功した。
全長BoNTの部位特異的蛍光標識：BoNTの動態を解析するために、PCR産物を鋳型にした無細胞タンパク質発現系により、N-末端が蛍光標識された全長BoNT/Aおよび全長BoNT/Eの合成を試みた。BoNT/Aについては蛍光標識されたタンパク質を得ることは出来なかったが、BoNT/Eについては目的のサイズの蛍光標識タンパク質を得ることに成功して、ウェスタンブロッティング解析によりBoNT/Eであることを確認した。
三叉神経節におけるSNAP-25の切断：これまでの研究から、BoNTの疼痛抑制効果は、BoNTが知覚神経節でSNAP-25を切断、神経伝達物質の遊離を阻害することで得られると推察される。そこで、前年度に作製した種々の抗SNAP-25抗体を用いたウェスタンブロッティング解析により、ラット三叉神経節の初代培養細胞でSNAP-25が発現していることを確認、BoNT/AあるいはBoNT/Eの投与によってSNAP-25が切断されることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
解析ツールの開発や作製がほぼ上手くいき、BoNT/AとBoNT/Eの疼痛抑制効果の分子機序を解析するための準備が十分に整った。
また、ラット三叉神経節の初代培養細胞においてBoNT/AあるいはBoNT/E投与によるSNAP-25の切断を検証出来たことで、我々の考えているBoNTの疼痛抑制効果の分子機序に関する作業仮説が正しいと考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々の考えているBoNTの疼痛抑制効果の分子機序に関する作業仮説が正しいと考えられたので、当初の計画どおりに研究を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品を安く購入できたこと、一部の機器を無料で使用することが出来たために、共同実験室の使用料が当初予定していた金額よりも少なかったことなどにより、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ボツリヌス毒素の疼痛抑制効果の分子機序を明らかにするために、動物実験や培養細胞実験を推進する。したがって、動物や細胞培養関連試薬・消耗品を購入する。
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