| 研究課題/領域番号 |
26350591
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
西山 康裕 日本医科大学, 医学部, 助教 (20350077)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 脳虚血モデル / ミクログリア / 炎症性サイトカイン / マクロファージ |
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| 研究実績の概要 |
実験動物として雄性１１－１４週齢のC57BL/6Jマウスを用い、３０分間の中大脳動脈閉塞sutureモデルを作成した。脳梗塞モデル作成後、翌日（day1）、day3, day5に脳細胞の単離を行った。すなわち、脳を取り出しホモジュナイズした後に、Liberase CI（Roche社製）を用いて６０分間インキュベートを行い、比重法にて回収した。その後CD45およびCD11bで染色し、flow cytometry（Becton Dickinson社）で解析を行い、ミクログリアであるCD45intおよびCD11bhighの部分にgateをかけ、FACS-Diva (Becton Dickinson社)を用いてsortingし、RNAを抽出。その後cDNAを合成した。 Sortingは冷却水をまわしながら行うことで、細胞の劣化を可能な限り防ぐ事が可能であった。各サンプルは３匹の脳細胞を混ぜることで、脳梗塞モデルの梗塞体積や動物間のばらつきを防ぐこととした。また、コントロールとして脳梗塞モデルでないマウスを同様に扱った。各群のサンプルから各種サイトカイン、ケモカインの解析を開始した。主な結果として、ミクログリアに特徴的なCXCR1の発現はコントロールに比してday1で劇的に発現量が減少し、その後day5にかけて徐々に増加した。その他、proinflammatory cytokineおよびanti-inflammatory cytokineを各種検索した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当教室での実験環境の大きな変化により、モデルマウス作成からRNA抽出までの一連の流れを組むことが難しくなり、実験進度の大幅な遅延がみられた。また、遅延の中、あらかじめ得られたサンプルに対するrealtime PCRを行う実験系は比較的順調に進み、結果を得ることができたため、当初考えていた実験回数よりも減らせることができたため予算よりも少ない費用で実験可能であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
各種proinflammatory cytokineおよびanti-inflammatory cytokineをrealtime PCRで検討した結果、あらかじめ得られているマクロファージからの結果と詳細に比較検討が可能である。これをもとに、さらに新たなサイトカインなどのマーカーを検索したい。しかしながら、当教室での人的条件を含む実験環境の大きな変化により、方向性を変えざるを得なくなった。ようやく各種cytokine、chemokine検索は行うことができたものの、target geneを考慮したノックアウトマウスなどを用いた実験計画は変更せざるを得なくなった。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当教室での実験環境の大きな変化により、モデルマウス作成からRNA抽出までの一連の流れを組むことが難しくなり、実験進度の大幅な遅延がみられた。また、遅延の中、あらかじめ得られたサンプルに対するrealtime PCRを行う実験系は比較的順調に進み、結果を得ることができたため、当初考えていた実験回数よりも減らせることができたため予算よりも少ない費用で実験可能であった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今後は残されたサンプルを用いてDNA発現を網羅的にも行うことを検討し、マクロファージから得られた結果との比較により、脳梗塞後に起こるミクログリアと外来性マクロファージの連携などのメカニズムを検討していきたい。
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