研究課題
頭蓋骨縫合早期癒合症（Craniosynostosis）の原因遺伝子のひとつと考えられているNELL1は、頭蓋顔面の骨格形成に関与する分泌タンパク質をコードしており、その骨形成能を利用した骨再生治療への応用が試みられている。しかし、NELL1が骨形成を制御するメカニズムの詳細はよくわかっていない。本研究課題では、(1) NELL1受容体の同定と下流のシグナル伝達経路の解明、(2) NELL1タンパク質の機能領域の同定とそれらの改変による新規骨形成因子の創成を試み、NELL1およびNELL1受容体の機能を応用した骨再生治療法を開発することを目的とした。本年度はおもに、前年度に引き続きNELL1タンパク質の機能領域の解析に取り組んだ。NELL1タンパク質のN末端側に位置するTSPNドメイン（ラミニンGドメインに類似）内のヘパリン結合部位を部位特異的変異法により探索し、5箇所のリジンまたはアルギニン残基を同定した。分子シミュレーション解析によると、これらのアミノ酸残基はいずれもタンパク質表面上の近い距離にある2箇所の正電荷パッチに位置しており、これらのアミノ酸置換変異体ではヘパリン結合活性に加えて細胞結合活性も消失することを明らかにした。NELL1と細胞との結合は、ヘパラン硫酸の添加によって阻害されることから、以上の結果と併せて、NELL1が細胞表面の膜貫通型ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合して、下流のシグナル伝達が調節されている可能性が示唆された。
3: やや遅れている
NELL1の受容体として、これまでにインテグリン分子を同定し、さらに膜貫通型のヘパラン硫酸プロテオグリカンがNELL1の共受容体として機能することを明らかにした。しかし、NELL1が関与する骨分化誘導には他の受容体が必要であることが示唆されているため、新規NELL1受容体の同定が必須である。NELL1タンパク質の機能領域の同定については、TSPNドメインを中心としたN末端側の解析は進んでいるが、EGF様ドメインなどを含むC末端側についてはタンパク質発現の困難さから、N末端側ほどには進んでいない。
最近、NELL遺伝子ファミリーのひとつであるNELL2の新規受容体として、神経系の軸索誘導に重要な働きをしている１回膜貫通型受容体であるRobo3が同定されたという報告がなされた。NELL1とNELL2はアミノ酸レベルで72%の相同性をもつが、NELL2は神経系の発達には関与するものの骨形成能は示さない。当該論文ではNELL1とRobo3の結合も示されたが、Robo3は骨形成に関与する間葉系細胞や骨芽細胞での発現は知られてない。したがって本研究では、NELL1の新規受容体候補として、Roboファミリー遺伝子を想定し、これらの発現とNELL1との結合の有無を調べる予定である。また、Robo3の結合部位はNELL2のC末端側のEGF様ドメインであることが示されたことから、NELL1のC末端側の機能解析を重点的に進める予定である。
研究の進捗状況により、前年度に計画した新規NELL1受容体のスクリーニングの実施に至らなかった。また、国際学会への発表を控え、投稿料が不要な雑誌に論文発表した点も関わっている。
新規NELL1受容体の同定およびNELL1の機能領域の解析を積極的に推進するのに必要な試薬等の他、最終年度のまとめとして、投稿論文の作成・出版および学会発表に必要な資金として使用する。
すべて 2015
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (1件)
FEBS Letters
巻: 589 ページ: 4026-4032
doi: 10.1016/j.febslet.2015.11.032. Epub 2015 Nov 26.
