| 研究課題/領域番号 |
26350984
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| 研究機関 | 徳島文理大学 |
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研究代表者 |
宋 時栄 徳島文理大学, 大学共同利用機関等の部局等, 教授 (00399693)
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| 研究分担者 |
中島 健太郎 徳島文理大学, 大学共同利用機関等の部局等, 助手 (20449911)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | SCD / アルツハイマー病 / 病態モデルマウス / 樹状突起 / シナプス / 免疫組織化学 |
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| 研究実績の概要 |
1. 脳内におけるSCD isoformの発現： マウスの脳では主にSCD1とSCD2が発現していることが分かっているが、成熟マウスの脳の大脳皮質、放射状層、錐体細胞層を取り分けてreal-time PCRを行なってみると、SCD2 mRNAの発現がSCD1 mRNAのそれぞれ8倍、12倍、34倍程度多かった。オリゴデンドログリアではSCD2が主に発現していることと合わせて、正常の脳内で主に発現しているのはSCD2であることが分かった。
2. SCD-1、2を識別できる抗体の作成： これまで用いてきた抗SCD抗体は、マウスSCD-2のC末に近い18アミノ酸を抗原として得られたもので、SCD-1とは17アミノ酸が共通しており、両者を認識する。このため、様々な病変においていずれのアイソフォームが変化しているのかを検討するには不向きであった。そこで相同性の低いN末端領域のアミノ酸配列の中から抗原ペプチドを設計し、両者を識別できる抗体を作成し、Western blot でrecombinant SCD1、2蛋白を区別できる抗体が得られた。
3. 実験的脱髄過程でのSCD2の変化： Cuprizone 経口投与によって誘発した脱髄、それに引き続く髄鞘再生過程でのSCD2 mRNA、SCD2蛋白の発現をreal-time PCR、Western blot 分析で検討した。脱髄進行時には白質のFluoroMyelin Green 陽性の髄鞘の面積は対照の6％程度まで減少し、その単位面積当りのSCD2蛋白は対照の80％程度に減少していた。一方、同じ時期に、白質でのSCD2 mRNAの発現は対照の150％程度に増大していた。髄鞘再生期にはSCD2mRNA、SCD2蛋白は対照の3-4倍程度の発現を示すことから、脱髄過程では他の髄鞘構成蛋白に先駆けてSCD2 mRNA が増大することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまで準備して来たlaser capture microdissection（以下LCM）と組み合わせたreal-time PCRの有用性を、実験的脱髄モデルマウスという個体レベルの実験系で確認することができた。これを用いて、アルツハイマー病モデルマウスでの解析を加速することが期待できる。
また、SCD-1、2を識別できる抗体の作成は、これまで何度か試みて成功しなかったが、今回有望な抗体を作出することができた。これまで様々な病態モデルマウスを用いて行なった検索結果から、脳の虚血性病変、脱髄性病変、アルツハイマー病のような神経変性病変において神経細胞やアストロサイト、オリゴデンドログリアにおけるSCDの発現変化が確認されているが、その機能的意義を考えていく上では、SCD-1、2いずれのアイソフォームが変化しているのかを同定することは基礎的知見である。従来、この点の検討は in situ hybridization によってのみ行なってきたが、今回、両者を識別できる抗体を作成できたことで、新たな解析手段が加わった。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 3 x Tg-ADマウスでの解析（病理組織学的ならびにLCMを用いた分子生物学的解析）
LCMと組み合わせたreal-time PCRは、病理組織学的解析と細胞レベルでの遺伝子発現解析を同一組織切片で行なうことができる有力な解析手法である。今回、比較的短時間で作成できる、cuprizone 経口投与による実験的脱髄モデルマウスを用いて、これらの手法の個体レベルの脳での解析における有用性が確認されたので、今後は本研究の主題であるアルツハイマー病モデルマウスを用いて長期に亘る継時的変化を追跡し、その過程での海馬の放射状層、錐体細胞層におけるSCD1、2の変化を解析する。またその時期に、これらの領域でどのような遺伝子発現変化が起こるのかを合わせて解析し、アルツハイマー病におけるSCDの機能的役割を探索する。
2. 抗SCD1、2特異的抗体の組織レベルでの characterization
今回得られた、Western blot 分析でrecombinant SCD1、2蛋白を区別できる抗体を用いて、様々な年齢の3 x Tg-ADマウスでの 免疫組織化学的解析を進め、このモデルマウスの6ヶ月齡で見つかった樹状突起領域（海馬の放射状層）でのSCDの発現変化がいつから見出されるようになるのか、また病気の進行に従ってアストロサイト、ミクログリアでのSCD1、2の発現に変化が認められるかどうかを検討する。合わせてWestern blot 分析によって、SCD1、2蛋白の継時的変化を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
3 x Tg-ADマウスの自家繁殖の効率、哺育状況が必ずしも順調でなく、研究計画で予定した数の仔が得られなかったため、生後発達過程でのSCD発現解析の一部が翌年にすれこみ、それに必要な経費の支出を次年度に繰り越したため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度に、3 x Tg-ADマウスの生後発達過程でのSCDの発現解析に用いる分子生物学的試薬、Western blot 分析用の試薬（概算で53万円）を支出する予定である。
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