研究課題
ヒトの体内で重要な働きをするタンパク質の多くは、濃度を～μＭにまで高めないと、効果的にリガンドと結合して特異的な機能を発現することができない。しかしながら、従来の１分子蛍光イメージング法では、このような高濃度条件下で目的の１分子だけを可視化することは不可能であった。そこで、改良型ゼロモード導波路（ＺＭＷ）と蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）とを融合した新しいリアルタイム１分子蛍光イメージングを開発することを目的として以下の実験を進めた。（１）モレキュラービーコン（ＭＢ）を用いたＤＮＡ折り畳みの１分子蛍光イメージング： 平成２６年度の成果（ＦＲＥＴ効率が低下しないＺＭＷ構造設計）を基盤として問題点（ＭＢの開閉制御性）の改良に取り組んだ。溶液を含ませたＺＭＷの温度（室温～１００℃）を構築し、制御温度に対するＭＢの開閉とＦＲＥＴ計測を行った。温度上昇に伴うＦＲＥＴ効率の低下が知られているが、１分子計測の問題になるほどではなかった。温度によるＭＢ開閉の制御性について、ハイブリダイゼーションによる開閉制御性（平成２６年度実施）に比して優位性は見られなかった。（２）インフルエンザ由来のエンドヌクレアーゼがＤＮＡに結合・ＤＮＡを切断・ＤＮＡから解離する素過程の１分子蛍光イメージング： ＺＭＷ内に固定した１本鎖ＤＮＡの末端とエンドヌクレアーゼとをそれぞれＣｙ５とＧＦＰとで蛍光標識し、２色の１分子蛍光イメージングを実施した。（１）で構築した温度制御系により、ＺＭＷに固定されたＤＮＡの切断に対する活性を１分子レベルで定量的に評価した。１本鎖ＤＮＡ切断に伴い、ＧＦＰ修飾エンドヌクレアーゼ由来の蛍光を検出することにも成功した。
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