| 研究課題/領域番号 |
26410174
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
工藤 史貴 東京工業大学, 理工学研究科, 准教授 (00361783)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | アミノグリコシド抗生物質 / ネオマイシン / ラジカルSAM酵素 / 鉄－硫黄クラスター / EPR解析 / 生合成 / アプラマイシン / イスタマイシン |
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| 研究実績の概要 |
アミノグリコシド抗生物質ネオマイシンBの生合成の最終段階は、ラジカル S-アデノシル-L-メチオニン（SAM）酵素NeoNによるネオマイシンCの5’’’位のエピメリ化である。本研究ではまず、重水で調製した緩衝液を用いて酵素反応を行い、重水素を含む生成物を単離・構造決定した。その結果、生成物の5’’’位に重水素が取り込まれたことが判明し、この部位でエピメリ化が進行することが明らかとなった。さらに、NeoNのシステイン残基のアラニンスキャンニングの結果、エピメリ化活性を有さない変異体の反応液中に、ラジカル反応中間体が生じていることがEPR解析により明らかになった。結果、SAMの還元的開裂反応により生じた5’-デオキシアデノシルラジカルが、5’’’位の水素を引き抜くことによりラジカル中間体が生じ、エピメリ化が触媒されることが明らかとなった。また、変異を導入したシステインが水素供給源となり、エピメリ化が完了することも合わせてわかった。
アプラマイシンとトブラマイシン生合成における3’位デオキシ化に関与すると推定したラジカルSAM酵素AprD4の機能解析も進めた。種々検討した結果、アプラマイシン生合成遺伝子クラスターにコードされているNADH/NADPH依存の推定還元酵素AprD3を共存させ、生合成中間体の一つであるパロマミンと反応させた時に3’位デオキシ化生成物が生じることが明らかとなった。
イスタマイシン生合成に関しては、生合成遺伝子クラスター中のラジカルSAM酵素IstL, IstL2, IstL3の発現系を構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ネオマイシン生合成におけるラジカルSAM酵素NeoNの反応機構解析に関しては、計画していたことを概ね遂行し、結果として論文発表と学会発表をすることができた。
アプラマイシンとトブラマイシン生合成におけるラジカルSAM酵素の機能解析に関しては、期待したような酵素活性を見出すことに成功した。一方で、部位特異的アミノ酸変異導入などによる詳細な反応解析には至らなかった。
イスタマイシン生合成におけるラジカルSAM酵素に関しては、次年度に向けて、酵素発現系を構築した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ネオマイシン生合成におけるラジカルSAMエピメリ化酵素NeoNに関しては、概ね反応機構を解明することができたので、今後は、様々な化合物を基質として受け入れるかどうか検討し、酵素を用いた新規のアミノグリコシド抗生物質創成を目指す。
アプラマイシン・トブラマイシン生合成における3’位デオキシ化に関わるラジカルSAM酵素AprD4の反応機構解析に関しては、H27年度には本格的に実施する。特に部位特異的アミノ酸変異導入による詳細な反応解析を行う。また、AprD4の反応生成物の単離には至っていないので、誘導体化するなどして単離構造決定を試みる。H27年度は、AprD4の機能解析を徹底的に行う。
イスタマイシン生合成におけるラジカルSAM酵素に関しては、基質も決定できていないので、まずは生合成初期に関わる酵素の機能解明も進め、基質となりうる生合成中間体を調製する。そして、発現させたラジカルSAM酵素IstL, IstL2, IstL3と混合することで、それら酵素の機能を解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H26年度に計画していたAprD4の部位特異的アミノ酸変異実験を、次年度に行うことにしたので繰り越した。また、H27年12月にホノルルで開催されるPacifiChem2015にて招待講演を依頼されたが、旅費は自己負担であり、それを確保するために経費をやり繰りした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
AprD4の部位特異的アミノ酸変異実験を行うために、各種プライマー用オリゴヌクレオチドを購入する。また、その実験に伴う消耗品の購入とシークエンス解析費用にあてる。また、PacifiChem2015に参加するために外国旅費として使用する。
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