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昨年度までに、アプラマイシン生合成遺伝子クラスターにコードされるラジカルS-アデノシルメチオニン（SAM）酵素AprD4とNADPH依存の還元酵素AprD3が、パロマミンのC3′位のデオキシ化を触媒し、リビダミンを生成する酵素であることを解明していた。今年度は、AprD4により生成すると推定された4′-オキソリビダミンを単離すべく研究を進めた。しかしながらAprD4反応生成物は単離困難であったので、立体選択的に重水素標識したNADPHとAprD3を用いて還元し、重水素化されたリビダミンを得ることで、その存在を証明した。また、AprD3がNADPHの4S水素を使って還元することも明らかとなった。
さらに、AprD4とAprD3の基質特異性を明らかにするため、パロマミン類縁体を用いて酵素反応解析を行った。AprD4による反応生成物の一つである5′-デオキシアデノシンの生成を追跡した結果、パロマミンだけではなく、ネアミン、カナマイシンC、カナマイシンBがAprD4の基質となることがわかった。一方、2′-N-アセチルパロマミンを用いた場合には、5′-デオキシアデノシンが検出されなかったので、パロマミンのC2のアミノ基はフリーである必要があることがわかった。つづくAprD3による還元反応により生じる生成物を分析した結果、カナマイシンCはデオキシ化体まで変換されることがわかった。一方、ネアミンとカナマイシンBを用いた場合には、相当する生成物は検出されなかった。従って、AprD3の基質認識はAprD4よりも厳密であり、パロマミンのC6の官能基は水酸基である必要があることがわかった。
また今年度は、ネオマイシン生合成におけるラジカルSAMエピメリ化酵素NeoNに関して、University of SouthamptonのPeter L. Roach教授との共同研究により結晶化に成功した。
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