| 研究課題/領域番号 |
26410186
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| 研究機関 | 横浜薬科大学 |
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研究代表者 |
小俣 義明 横浜薬科大学, 薬学部, 教授 (20268840)
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| 研究分担者 |
梶原 康宏 横浜薬科大学, 薬学部, 准教授 (50460283)
川嶋 剛 横浜薬科大学, 薬学部, 准教授 (60460284)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ポルフィリン生合成 / ポルフィリン症 / ウロポルフィリノーゲンIII合成酵素 / ハイドロキシメチルビラン合成酵素 / ポルホビリノーゲン / ヘムタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
ウロポルフィリノーゲンIII合成酵素（UROS）によるポルフィリン環化反応の機構を構造生物学的に解明するため、基質となるハイドロキシメチルビラン（HMB）の誘導体を合成することとした。誘導体はHMBと共通の構造部位を持ち、UROSによって取り込まれるが、環化反応はできないよう化学的に修飾されたUROS阻害作用を有するアナログ化合物である。誘導体の合成には概ね2つの方法がある。第一法は、ポルホビリノーゲン（PBG）を原料とし、HMB合成酵素（HMBS）を用いてHMBを合成した後、直ちに塩基性条件下、ビラン側鎖のヒドロキシ基を他の官能基に変換させる半化学合成であり、第二法は、ピロール誘導体を用いて有機合成によってHMB誘導体を得る精密な全化学合成である。
第一法が原料は高価ではあるが、短時間で誘導体を供給できるため、第一選択として種々の条件検討を行った。反応経過をNMRによって調べたところ、HMBSの反応に時間を要し、生成物のHMBは速やかに自発的にウロポルフィリノーゲンIへと環化してしまい、誘導体を単離できないことが分かった。
半化学合成のための異なるアプローチとして、2-ヨードポルホビリノーゲン（2-I-PBG）を用いて、HMBSの酵素反応速度論解析とX線結晶構造解析を行った。Dixonプロット等による反応速度論解析の結果、2-I-PBGは非競合阻害を示し、阻害定数Kiは5 µMであった。また、HMBSと2-I-PBGとの複合体の結晶構造解析の結果、ジピロメタン補因子の遠位側ピロール近傍に2-I-PBGに相当する電子密度を認めた。これらの結果より、HMBSの補因子周辺に2-I-PBGが結合することによって、補因子と最初の基質PBGとの間での縮合反応が妨げられることを示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初は初年度に第一法であるHMBSを用いたHMB誘導体の合成に目途をつける計画で、原料であるPBGの調達と、ヒトHMBSの大腸菌での発現・精製を行った。HMBの自発的環化反応が早いことは文献調査から予測されていたが、本研究ではそのことを文献とは異なる方法で確認する結果となり、始めに計画していた合成方法を変更せざるをえなくなった。第二法の全化学合成は、既に行った第一法の一部改変ではなく、全く異なる原料からの異なるアプローチであるために、移行過程での予備実験が必要となり、当初の計画通りに達成できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
第二法によるHMB誘導体の全化学合成を行う。合成方法については、目的の誘導体をできる限り速やかに供給することを優先し、文献で既報の方法に準じて行う。既報とはいえ、原料となる2種類のピロール誘導体をそれぞれ6～8工程かけて合成し、両者をカップリングした後、さらに7～9工程かけて目的のHMB誘導体が得られる合成経路であり、それなりの実験量と時間を要することになる。また合成過程で問題が発生すればその都度、条件を検討して解決を図る必要があり、文献既報の方法であっても容易ではないことが予想される。しかし、合成過程の途中で得られる化合物は他の類似化合物の合成にも応用できるものであり、新規の誘導体の開発・合成に備えることができる。
HMB誘導体が得られた時にUROSのX線結晶化条件の検討を速やかに行えるように、ヒトUROSを大腸菌で発現・精製しておく。ヒトUROSは溶解度が低いために、現在用いている方法では収量が少なく結晶化条件の検討に充分供給できないので、培養・発現条件を更に改善し高収量の発現を目指す。またヒトUROSは溶解度の問題だけでなく熱に対して不安定であるので、並行して好熱菌由来のUROSのクローニングを行い、発現・精製系を確立して結晶化へ向けて供給できるようにする。
合わせてUROSの酵素学的性質を調べる目的で点突然変異酵素を作製し、それらの酵素反応速度を測定する。既に幾つかの変異酵素の解析から、Tyr168がUROSの反応に重要である知見を得ているが、周辺のアミノ酸残基を変異させた酵素を調製し、基質の結合および酵素反応に関わる部位を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請時の予定では、初年度はHMB誘導体を得ることを目的とし、原料として高価なPBGを用いた実験系の確立を行い、次のステップとしてスケールアップを行うことで、目的の誘導体を供給する計画であった。しかし、1回の使用量が10 mg程度の小スケールで種々の条件検討を行った時点で、PBGからの半化学合成では目的とする誘導体を得ることが困難であると分かり、高価なPBGの購入費用をそれほど多くは必要としなかった。
一方、第二法として行うことにした全化学合成では、工程が多く最終的な収率が極めて低いことが予想されるため、経済的な側面から原料をなるべく廉価に抑えることを条件に検討した合成方法の初期の段階を行っただけであり、使用額に差異が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在までの達成度がやや遅れていることから、誘導体合成にかかる費用を当初は計画していなかった2年目にも使用する。方針を変更してHMB誘導体の全化学合成を行うことになり、先ずはその原料となる、2種のピロール誘導体を合成する。これらの化合物の合成に当たっては、準備段階では小スケールで数工程なので、新たに試薬を用意する必要がほとんどなくさして費用もかからないが、先の工程に進むためには原料を大量に供給しなければならず、実験に伴って費用は増大し、十分な原料合成ができた後は多くの費用を必要としなくなる。
HMB誘導体の合成とともに、2年目以降に予定していた変異酵素の作製を並行して行ので、遺伝子操作および酵素の精製に関わる試薬・機器を調達する。
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