| 研究課題/領域番号 |
26420795
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| 研究機関 | 京都工芸繊維大学 |
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研究代表者 |
熊田 陽一 京都工芸繊維大学, 分子化学系, 准教授 (70452373)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 窒化ケイ素 / 単鎖抗体 / リフォールディング / 固定化 / 配向制御 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、前年度にシーズとして発見した単鎖抗体のリフォールディング技術の確立について主に検討を行った。単鎖抗体は、大腸菌内で主に封入たいとして発現し、高原結合活性を有する活性型に構造変化させるための操作（すなわちリフォールディング操作）が必要となる。タグなし単鎖抗体は、大腸菌内で可溶化しやすく、N末端側にpelB reader シグナルを融合することでジャーファーメンターによって4g/Lもの生産性を達成することが鹿野であった。SiN-tagを融合した単鎖抗体（scFv-SiN）を大腸菌内で高発現させたところ、これまでのタグ付き単鎖抗体の結果と同様に封入体中に発現され、これらのリフォールディング操作が必要となった。前年度、タグ付き単鎖抗体の見かけの等電点を４～５付近となるようにC末端部にPoly D-tagを導入することで、リフォールディングにおける回収率を大幅に改善することを見出した。この現象の汎用性を証明するために、当研究室が保有する単鎖抗体12種類について、同様の現象が実施可能かを検討した。単鎖抗体の等電点は、それぞれのアミノ酸配列によって異なるが、おおむね６～８の範囲であり、ポリアスパラギン酸（D-tag)の導入によって見かけの等電点を４～６の範囲まで減少させることを見出した。これらをｐH８．５の条件で透析リフォールディングを行うことで、回収率を９０％以上に向上することが可能であった。これらの結果より、SiN-tag融合単鎖抗体の汎用的な生産技術を確立することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画に沿って順調に進捗している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度、得られたタグ付き単鎖抗体の生産技術・リフォールディング技術をもとに、これらをSiN基板上に固定化するための種々の条件検討を行う。さらにSiN基板を用いたRIｆSセンサを用いて、固定化量の把握、さらには、SiN基板上における単鎖抗体の残存活性について定量評価を行う。
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