ヒト肝細胞キメラマウスとバキュロウイルスを用いた遺伝病モデルの創生

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26420796
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 茶山 弘美 広島大学, 医歯薬保健学研究院(医), 准教授 (70572329)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: ゲノム編集 / 遺伝性肝疾患 / ヒト肝細胞キメラマウス

研究実績の概要

本研究ではこれまでに、本邦の小児科における罹患率の高い代表的な遺伝性肝疾患であるヘモクロマトーシス、ポルフィリン症、糖原病、アミノ酸代謝異常症、尿素サイクル代謝異常症、体質性黄疸、線維性嚢胞性肝疾患、ウィルソン病の原因遺伝子をノックアウトまたは変異を起こさせるようなCRISPR-Cas9システムのバキュロウイルスベクターのコンストラクトを作製した。具体的には代謝酵素の欠損により引き起こされる尿素サイクル異常症や体質性黄疸はそれぞれ原因遺伝子をノックアウトするコンストラクトを作製した。また、遺伝子の変異によって引き起こされるようなヘモクロマトーシス、ポルフィリン症、糖原病、アミノ酸代謝異常症、ウィルソン病は、変異が起こる部位をノックアウトするコンストラクトと変異を導入するようなドナーコンストラクトの2種類を作製した。作製したコンストラクトをHEK293細胞にトランスフェクションし、培養上清中に産生されたバキュロウイルス粒子を回収し、増幅する。得られたバキュロウイルス粒子を含む培養上清の希釈系列を作製しHepG2細胞、Huh7細胞等の細胞株に添加してバキュロウイルス感染価を求めた。細胞に感染させると著しく細胞の増殖が低下するものが多くみられベクターの改良が必要であると考えられた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

ヘモクロマトーシス、ポルフィリン症、糖原病、アミノ酸代謝異常症、尿素サイクル代謝異常症、体質性黄疸、線維性嚢胞性肝疾患、ウィルソン病の原因遺伝子をノックアウトまたは変異を起こさせるようなCRISPR-Cas9システムのバキュロウイルスベクターのコンストラクトを作製した。in vitroの実験では、細胞増殖を低下させるコンストラクトがあり改良を試みた。最新のゲノム編集技術を用いた研究論文を参考にさらに良いモデル作製方法を検討中であるため。

今後の研究の推進方策

平成２８年度は、2014年にCell (Platt et al)に報告された方法を参考にして、臓器特異的に特定の遺伝子のノックアウト、ノックインを起こすようなin vivoの系を確立させ疾患モデルを作製し、疾患発症機構の解明を行う。疾患発症機構の解析を行う中で得られた情報から治療薬となり得る分子について創薬に向けた研究を行う。また、分子間の相互作用が疾患の発症に関係する場合にはそれらの分子間相互作用を促進あるいは阻害するような低分子化合物のスクリーニングを行う。

研究成果

• [雑誌論文] Elimination of HCV via a non-ISG-mediated mechanism by vaniprevir andBMS-788329 combination therapy in human hepatocyte chimeric mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Uchida T, Hiraga N, Imamura M, Yoshimi S, Kan H, Miyaki E, Tsuge M, Abe H, Hayes CN, Aikata H, Ishida Y, Tateno C, Ellis JD, Chayama K.
  • 雑誌名: Virus Res. 巻: 213 ページ: 62-68
  • DOI: 10.1016/j.jinf.2015.09.038. Epub 2015 Oct 26.
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Effect of tenofovir disoproxil fumarate on drug-resistant HBV clones. (2016)
  • 著者名/発表者名: Murakami E, Tsuge M, Hiraga N, Kan H, Uchida T, Masaki K, Nakahara T, Ono A, Miki D, Kawaoka T, Abe H, Imamura M, Aikata H, Ochi H, Hayes CN, Akita T, Tanaka J, Chayama K.
  • 雑誌名: J Infect. 巻: 72 ページ: 91-102
  • DOI: 10.1016/j.jinf.2015.09.038. Epub 2015 Oct 26.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Human Cytotoxic T Lymphocyte-Mediated Acute Liver Failure and Rescue by Immunoglobulin in Human Hepatocyte Transplant TK-NOG Mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Uchida T, Hiraga N, Imamura M, Tsuge M, Abe H, Hayes CN, Aikata H, Ishida Y, Tateno C, Yoshizato K, Ohdan H, Murakami K, Chayama K.
  • 雑誌名: J Virol. 巻: 89 ページ: 10087-10096
  • DOI: 10.1128/JVI.01126-15. Epub 2015 Aug 5.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Rapid, Sensitive, and Accurate Evaluation of Drug Resistant Mutant (NS5A-Y93H) Strain Frequency in Genotype 1b HCV by Invader Assay. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshimi S, Ochi H, Murakami E, Uchida T, Kan H, Akamatsu S, Hayes CN, Abe H, Miki D, Hiraga N, Imamura M, Aikata H, Chayama K.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 10 ページ: e0130022
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0130022. eCollection 2015.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Long term persistence of NS5A inhibitor-resistant hepatitis C virus in patients who failed daclatasvir and asunaprevir therapy. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshimi S, Imamura M, Murakami E, Hiraga N, Tsuge M, Kawakami Y, Aikata H, Abe H, Hayes CN, Sasaki T, Ochi H, Chayama K.
  • 雑誌名: J Med Virol. 巻: 87 ページ: 1913-1920
  • DOI: 10.1002/jmv.24255. Epub 2015 Jun 16.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Novel Robust in Vitro Hepatitis B Virus Infection Model Using Fresh Human Hepatocytes Isolated from Humanized Mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ishida Y, Yamasaki C, Yanagi A, Yoshizane Y, Fujikawa K, Watashi K, Abe H, Wakita T, Hayes CN, Chayama K, Tateno C.
  • 雑誌名: Am J Pathol. 巻: 185 ページ: 1275-1285
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2015.01.028. Epub 2015 Mar 17.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association between variants in the interferon lambda 4 locus and substitutions in the hepatitis C virus non-structural protein 5A. (2015)
  • 著者名/発表者名: Akamatsu S, Hayes CN, Ochi H, Uchida T, Kan H, Murakami E, Abe H, Tsuge M, Miki D, Akiyama R, Hiraga N, Imamura M, Aikata H, Kawaoka T, Kawakami Y, Chayama K.
  • 雑誌名: J Hepatol. 巻: 63 ページ: 554-563
  • DOI: 10.1016/j.jhep.2015.03.033. Epub 2015 Apr 4.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Analysis of the effect on HBV life cycle by HBV genome editing using two different CRISPR/Cas9 systems. (2015)
  • 著者名/発表者名: Abe H, Masaki K, Sakuma T, Tsuge M, Hiraga N, Imamura M, Hayes CN, Aikata H, Yamamoto T, Chayama K.
  • 学会等名: The 66th AASLD Annual Meeting
  • 発表場所: San Francisco, USA.
  • 年月日: 2015-11-13 – 2015-11-17
  • 国際学会