中枢ストレス反応におけるグルタミン酸トランスポーターの機能解析

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26430003
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 安田 浩樹 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60294071)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: PKN1 / 代謝型グルタミン酸受容体 / グルタミン酸トランスポーター / ストレス

研究実績の概要

プロテインキナーゼPKN1は、中枢神経系に広く発現していることから、PKN1の中枢神経系における機能をPKN1aノックアウトマウスを用いて解析したところ、①海馬CA1において代謝型グルタミン酸受容体依存性シナプス伝達長期抑圧が亢進し、周囲のシナプスにも広がる、②海馬歯状回において代謝型グルタミン酸受容体依存性興奮が亢進し、ストレス負荷と同じ効果があった。これら①、②のフェノタイプは、グルタミン酸トランスポーター阻害剤で再現され、また神経型トランスポーター excitatory amino acid transporter 3 (EAAT3)活性が、キナーゼ活性のないPKN1強制発現によって低下する。PKN1は正常脳においては神経にのみ発現していることから、PKN1は神経型グルタミン酸受容体を活性化することによってシナプス間隙や細胞外グルタミン酸濃度を低下させ、主に代謝型グルタミン酸受容体機能を正常化していると考えられる。現在は、PKN1が神経型グルタミン酸トランスポーターを活性化するメカニズムを検索している。プロテインキナーゼC(PKC)がEAAT3の細胞表面での発現を増強していると報告されているので、PKN1も同様の効果があるか否か、培養神経細胞を用いて生化学的に検索している。今後はストレス負荷によるEAAT3の神経細胞膜への発現の変化、およびPKN1のEAAT3発現への関与を生化学的に検討していく予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

今年度中に培養神経細胞を用いて、細胞膜表面上の神経型グルタミン酸トランスポーター(excitatory amino acid transporter 3, EAAT3)発現に対するPKN1の制御を調べる目的で、抗EAAT3抗体やビオチニレーションキット等高額な試薬の購入のために物品費100万円の使用を予定していた。ところが本年度中に、別のプロジェクトの結果について投稿した論文のリバイスが必要になったため、抗EAAT3抗体を用いた実験が時間的に不可能になり次年度に持ち越しになった。

今後の研究の推進方策

上述の通り、神経細胞膜表面上のEAAT3発現に対するPKN1の制御を調べる実験を遂行するために、抗EAAT3抗体やビオチニレーションキットを購入して、表面EAAT3発現を定量する実験を次年度に行う予定である。また、ビオチニレーションを使わずに簡便に膜蛋白を抽出する方法(Minute Plasma Membrane Isolation kit)を用いて、マウス海馬組織からEAAT3蛋白を定量してPKN1によるEAAT3膜表面発現の制御を検討する予定である。

次年度使用額が生じた理由

今年度中に培養神経細胞を用いて、細胞膜表面上の神経型グルタミン酸トランスポーター(excitatory amino acid transporter 3, EAAT3)発現に対するPKN1の制御を調べる目的で、抗EAAT3抗体やビオチニレーションキット等高額な試薬の購入のために物品費100万円の使用を予定していた。ところが本年度中に、別のプロジェクトの結果について投稿した論文のリバイスが必要になったため、抗EAAT3抗体を用いた実験が時間的に不可能になり次年度に持ち越しになったため、これらに該当する今年度予算が次年度に繰り越しになった。

次年度使用額の使用計画

上述の通り、神経細胞膜表面上のEAAT3発現に対するPKN1の制御を調べる実験を遂行するために、抗EAAT3抗体やビオチニレーションキットを購入して、表面EAAT3発現を定量する実験を次年度に行う予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Turning off of GluN2B subunits and turning on of CICR in hippocampal LTD induction after developmental GluN2 subunit switch. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hiroki Yasuda and Hideyuki Mukai
  • 雑誌名: Hippocampus 巻: 25 ページ: 1274-1284
  • DOI: 10.1002/hipo.22435
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. (2014)
  • 著者名/発表者名: Naoko H. Tomioka, Hiroki Yasuda, Hiroyuki Miyamoto, Minoru Hatayama, Naoko Morimura, Yoshifumi Matsumoto, Toshimitsu Suzuki, Maya Odagawa, Yuri S. Odaka, Yoshimi Iwayama, Ji Won Um, Jaewon Ko, Yushi Inoue, Sunao Kaneko, Shinichi Hirose, Kazuyuki Yamada, Takeo Yoshikawa, Kazuhiro Yamakawa, Jun Aruga
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 5 ページ: 4501 (page1-16)
  • DOI: doi:10.1038/ncomms5501
  • 査読あり
• [学会発表] Elfn1はmGluR7をシナプス前部に集積させ、てんかんや多動症の発症に関与する (2014)
  • 著者名/発表者名: 富岡 直子, 安田 浩樹, 宮本 浩行, 山田 一之, 吉川 武男, 山川 和弘, 有賀 純
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-26
• [学会発表] Myosin II ATPase activity mediates the biphasic movement of stable F-actin bound by drebrin A between dendritic spines and the parent dendrite in long-term potentiation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Shirao, Toshiyuki Mizui, Noriko Koganezawa, Hideo Shimizu, Hiroki Yasuda, Yuko Sekino
  • 学会等名: Neuroscience 2014 (44th Annual Meeting of the Society for Neuroscience)
  • 発表場所: Washington, DC (米国)
  • 年月日: 2014-11-19
• [学会発表] Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss cause epilepsy, hyperactivity, and attention deficit. (2014)
  • 著者名/発表者名: J. ARUGA, N. H. TOMIOKA, H. YASUDA, H. MIYAMOTO
  • 学会等名: Neuroscience 2014 (44th Annual Meeting of the Society for Neuroscience)
  • 発表場所: Washington, DC (米国)
  • 年月日: 2014-11-16
• [学会発表] PSD-Zip70によるRap2活性調節を介したシナプス形成制御 (2014)
  • 著者名/発表者名: 真柳 平, 安田 浩樹, 祖父江 憲治
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2014-10-16
• [学会発表] グルタミン酸トランスポーターを介したPKN1による代謝型グルタミン酸受容体機能制御 (2014)
  • 著者名/発表者名: 安田 浩樹、山本 光、川又 敏夫、向井秀幸
  • 学会等名: 第37回日本神経科学学会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-09-11