研究課題
申請者は、高度に保存されたgC1qドメインを持つC1q/TNFファミリーに属するCbln1が、シナプス前部にてNeurexin、シナプス後部にてδ2グルタミン酸受容体（GluD2）という2つの受容体に同時に結合する、全く新しいタイプのサンドウィッチ型シナプスオーガナイザーであることを明らかとしてきた。さらに、我々のグループは同じC1q/TNFalphaファミリーに属する新たな分泌タンパク質C1q様分子（C1q-like: C1qL)がそれぞれ非常に特徴のある領域に限局して発現しており、Cblnファミリーとは同じ脳領域であっても相補的な部位のシナプスに局在することを見出した。申請者は、この発現パターンと両者の構造の類似性から、C1qLサブファミリーのシナプスオーガナイザーとしての作用に着目し、特にC1qL2及びC1qL3が合成、分泌される海馬歯状回苔状線維－CA3シナプスシナプスでの機能を探索する目的で、C1qL2、C1qL3遺伝子欠損マウスを作製した。C1qLサブファミリーによるシグナル伝達経路解明にはその受容体の同定が必須である。本年度は申請者はこのマウスの解析からC1qL2及びC1qL3の受容体を同定できた。さらにこの受容体の欠損マウス作成し、このマウスでは分泌性シナプスタンパク質であるC1qL2及びC1qL3のシナプスでの安定化が著しく低下していた。このことはこの受容体がvivoにおいてもC1qL2及びC1qL3をシナプスにつなぎとめる受容体として機能することを強く示唆している。このように、小脳におけるCbln1のみならず、同じファミリー分子であるC1qLにおいても、受容体‐C1q/TNFファミリー複合体が、海馬シナプスに形成されることを新たに発見することができた。
1: 当初の計画以上に進展している
C1qL2及びC1qL3の遺伝子欠損マウスを作製し、本年度はこのマウスの解析からC1qL2及びC1qL3の受容体を同定できた。さらにこの受容体の欠損マウスを作製した。この欠損マウスでは分泌性シナプスタンパク質であるC1qL2及びC1qL3のシナプスでの安定化が著しく低下していた。このことはこの受容体がC1qL2及びC1qL3をシナプスにつなぎとめる受容体であることを強く示唆している。これまで複数の受容体候補を得ていたが、vivoでのC1qLと受容体の相互作用を示すことができた点で、期待以上の成果を得られたと考えている。つぎにC1qL2及びC1qL3が合成、分泌される海馬歯状回苔状線維－CA3シナプスに注目し、シナプス伝達を解析した。C1qL2, C1qL3ダブルノックアウトマウス顕著にシナプス後電流が激減していることが明らかとなった。しかしながらシナプス後部CA3錐体細胞において、PSD95などのシナプス局在変化は観察されなかった。これまで得られた結果はC1qL2, C1qL3がシナプス後部を機能的に分化させるシナプスオーガナイザーであることを示唆するものである。ファミリー分子であるCbln1は、シナプス後部のみならずシナプス前部をも分化させ両方向性に機能的なシナプスを作り上げた。そこでC1qL2, C1qL3がシナプス前部を分化させる可能性を探るため、苔状線維－CA3シナプスにおいてシナプス前部構造およびシナプス前部マーカーの局在を光学顕微鏡にて詳細に解析したが、C1qL2,3ダブルノックアウトマウスにおいて顕著な形態変化は見られなかった。また、Cbln1で観察されたように、C1qL2, C1qL3が直接シナプス前部の分化を誘導しうるかをリコンビナントC1qL2, C1qL3ビーズへのシナプス前部接着で解析したが、このような効果は観察されなかった。
１）C1qL2,3は成熟脳においても発現、合成され続けている。そこで発達時に新たに形成されるシナプスのみならず、成熟脳ですでに形成された既存のシナプスにおいて、C1qL2, C1qL3がシナプス維持に働く可能性を検討する。C1qL2,3と同定した受容体の相互作用を阻害するdecoy peptideを得ることができた。内在性のC1qL機能を阻害するこのpeptideを脳室に微小注入する実験を行う。われわれの作成したc1qL3ノックアウトマウスは、Cre-loxPシステムによって成熟後にC1qL遺伝子を欠損させることが可能である。このマウスを解析することで成熟脳での機能を明らかにする。C1qL2,3のシナプス形成能の神経発生の時期依存性を明らかにする目的で、成熟後のノックアウトマウス個体脳にリコンビナントC1qL2,あるいはC1qL3を微小注入して、シナプス応答が回復するかを電気生理学実験にて解析する。２）C1qLファミリー分子は海馬において障害刺激や、てんかんモデルとして知られるカイニン酸投与によって遺伝子発現が増強する。得られた受容体候補遺伝子についても、そのリガンドであるC1qLと同じ発現調節機構があるかを検討する。３）発達に伴う正常な歯状回苔状線維－CA3シナプス構築のみならず、てんかん慢性化の動物モデルと考えられているカイニン酸処理やピロカルピン投与において観察される苔状線維の異常発芽、それに伴う歯状回分子層への反回性回路形成という病態時に観察される異常シナプス形成において、C1qL2, C1qL3がシナプス構築を制御しうるか、C1qL2, C1qL3ダブルノックアウトマウスを用いて解析する。
当初の計画を見直し、微細な形態観察に必要な共焦点レーザ走査型顕微鏡を複数課題により購入。予定より効率的に実験が進行した。そのため購入予定であったIn Vitro遺伝子導入装置 (CUY21Pro-Vitro)が不要となった。このため生じた価格差分を次年度に使用したい。
消耗品代、特に機能阻害ペプチド合成や抗体作成委託費として使用する予定である。
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Neuron
巻: 85 ページ: 316-329
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