| 研究課題/領域番号 |
26430029
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
宮下 俊雄 生理学研究所, 生体情報研究系, 特任助教 (80415314)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 多光子励起顕微鏡 / 大脳皮質局所神経回路 |
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| 研究実績の概要 |
大脳皮質局所神経回路形成の分子メカニズムを明らかにする事を目標として実験を行った。
KOマウスを使い局所神経回路形成への関わりを検証するために、KOマウス胎児より樹立したiPS細胞を野生型の受精卵に戻すことにより作製したキメラマウスを実験に用いた。当初クラスター型プロトカドヘリンの全アイソフォームを欠損したキメラマウスを実験に用いる予定でいたが、遺伝子欠損による腫瘍形成が顕著であり、実験に支障が生じた。そこで、異なる遺伝子を欠損した同様のキメラマウスを実験に用いた。本遺伝子はクラスター型プロトカドヘリンの各アイソフォームの発現制御に重要な役割を持つと考えられており、実際本遺伝子を欠損した小脳プルキンエ細胞ではプロトカドヘリンの全アイソフォームが発現する事が報告されている。つまりプロトカドヘリンの発現による各神経細胞の個性の獲得が阻害されていると考えられる。
本年度は本キメラマウスの大脳皮質の組織構築を、皮質層特異的に発現する遺伝子群の発現により確認した。それぞれCux2（皮質2/3層）、RORb（皮質4層） pcp4（皮質5，6層）を使い、これらマーカー遺伝子とiPS細胞由来の細胞群が発現するGFPとの二重in situ ハイブリダイゼーションを行った。KOマウス由来のキメラマウスに於いても、対照実験となる野生型GFPを発現するiPS細胞を用いて作製されたキメラマウスに於いても皮質層構造に変異は起きていないと確認できた。
そこでこれらの結果を踏まえ、次年度以降に予定していた二光子顕微鏡による局所神経回路の機能解析を始めた。現在までに実験主義の確立、解析プログラムの作製を行い、実際に一次視覚野に対してin vivoカルシウムイメージングを開始した。野生型キメラマウスを用いた実験によりiPS細胞由来の神経細胞が宿主由来の細胞と変わらずに視覚刺激に応答する事が確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度に予定した実験計画は、当初使用予定であったキメラマウスが腫瘍形成が著しく問題を感じたが、マウス系統を変える事で実験を進める事が出来た。蛍光二重in situハイブリダイゼーションによる大脳皮質の組織構築の検証は順調に進んだ。さらに使用した分子マーカーに対する抗体を入手し、これらを使い免疫染色をする事で同様の結果が得られることも確認できた。
また次年度以降に予定していたin vivoカルシウムイメージングも順調に進んでいる。
iPS細胞由来の細胞が発現するGFPと実験に使っているカルシウム指示薬の蛍光波長が重なるが、先行研究を参考にし取得画像上での切り分けもできた。実際に視覚刺激に対する反応も記録でき、解析も始められた。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在進行中のin vivoイメージングを引き続き行い、解析を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入予定であった機器に関して、所属研究機関で所有されている物の使用頻度が低く、当初想像していたよりも自由に使えたために早急に購入する必要がなかったため。また、実験動物は共同研究者より提供を受けたため、購入の必要がなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
所属研究室内で所外への移動があり、それに伴い実験器具の買い増しも必要になった。その為に機器を購入する。
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