| 研究課題/領域番号 |
26430036
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
尾身 実 藤田保健衛生大学, 医学部, 助教 (00400416)
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| 研究分担者 |
佐藤 真 大阪大学, その他の研究科, 教授 (10222019)
岡 雄一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30614432)
猪口 徳一 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60509305)
黒田 一樹 福井大学, 医学部, 助教 (60557966)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 神経科学 / 解剖学 / 神経回路 / 発生・発達 |
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| 研究実績の概要 |
錐体路は運動の制御を司る中枢神経の回路であり、大脳皮質第５層から皮質下に入り、脳幹を経て脊髄へとその神経軸索を伸ばす。また同時に脳内の複数の神経核にも側枝を投射し、複雑な神経回路網を形成する。本研究では、中枢神経系で形成される、長く複雑な軸索経路の伸長・形成の分子機構について明らかにすることを目的とする。
これまでに、大脳皮質第５層に発現している受容体分子の網羅的な探索と網羅的なノックダウン実験によって、錐体路の形成に関与すると考えられるシグナルの受容体分子の候補を複数得ている。これらの候補受容体分子について、ノックアウトマウスが存在するものは国内外の研究機関から脳組織を得て、蛍光色素DiIを用いて錐体路の解析を行ったが、顕著な異常は認められなかった。また、候補受容体分子のひとつについて、CRISPR/Cas9システムを用いてノックアウトマウスを作成した。作成したノックアウトマウスで錐体路の形態を観察したところ、顕著な異常は認められなかった。このことについては、候補受容体分子が、他の分子と協調的に機能している可能性が考えられる。
また、より詳細に候補受容体が関与するシグナルについて調べるため、神経細胞にリガンド分子を作用させた際の遺伝子発現の変化について検討することにした。神経細胞を獲得するにあたっては、大量の神経細胞を得ることの可能なマウスES細胞を使用した。ES細胞をSFEBq法により培養すると、大脳皮質に分化した神経細胞が安定して得られることが知られている。分化誘導した神経細胞に候補受容体分子のリガンドを作用させ、RNAを採取し、次世代シークエンスによるRNA-seqを行っているところであり、順次その結果を解析する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
候補受容体分子のうちノックアウトマウスの存在するものは、国内外の研究機関の協力を得て、脳組織を得ることが出来た。その脳組織を蛍光色素DiIを用いてラベルし、錐体路について解析したところ、顕著な異常は確認されなかった。また、ノックアウトマウスの入手が難しい候補受容体については、そのうちのひとつでCRISPR/Cas9システムを用いてノックアウトマウスの作成を行った。生まれてきた新生仔マウスの脳に蛍光物質DiIを注入し、数日後に固定して切片を作成し、錐体路の形成について調べた。その結果、顕著な異常は認められなかった。そのため、候補受容体分子群から、さらなる候補について検討する必要およびシグナルの作用機序について検討する必要が生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
候補となる受容体分子のノックアウトマウスの入手や作成を引き続き検討する。ノックアウトマウスにおいて錐体路の形成に異常が認められる受容体分子が見出せれば、その発現時期や発現部位の解析を進める。
また、候補受容体分子群について、結合しうるリガンドからも解析を進める。結合しうるリガンドは一受容体分子においても複数種にわたるため、初代神経細胞やES細胞由来の神経細胞の培養系を用いて、リガンドとなり得る分子を培養細胞に作用させ、神経細胞の軸索の形成や伸長・分枝形成に与える影響を解析し、候補受容体分子とシグナル経路の絞り込みを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
一部の実験において次年度に引き続き解析する必要性が生じたため、次年度での使用額が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究遂行に必要なものとして、神経細胞および神経細胞の軸索や神経突起などの染色に必要な、染色色素や抗体、および免疫染色に必要な各紙薬、細胞培養に必要な培地・血清などを計上した。また、分子生物学的実験に必要な試薬や各種酵素類、核酸類を計上した。また、これら実験に必要なプラスチック製品についても計上を行った。これらに加え、研究成果の発表と情報収集のための学会参加に掛かる費用と、論文を投稿する際に掛かる費用を計上した。
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