ATF6ノックアウトマウスを用いたALSの病態解明

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26430069
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 堀 修 金沢大学, 医学系, 教授 (60303947)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 神経変性 / 小胞体ストレス

研究実績の概要

筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態形成に細胞内小器官の一つ小胞体の障害、すなわち小胞体ストレスが関与している可能性が示唆されている。しかし、どの時期に、どの細胞で小胞体ストレス、並びに小胞体ストレス応答(UPR)が重要な役割を果たしているかについては明らかにされていない。そこで、我々はまず、ALSモデルマウスであるG93A SOD Tgマウス（以下、ALSマウス）を用いて、小胞体ストレス関連遺伝子であるGRP78の発現を検討した。その結果、同マウスにおいてはALS発症に先んじてGRP78の発現が、特に脊髄の運動神経で上昇することを認めた。次に、UPRの主幹転写因子であるATF6を欠損したマウス（ATF6 KOマウス）とALSマウスの交配を行い、得られたATF6 KO / ALSマウスの表現型を解析した。その結果、①同マウスにおいてはALSマウスに比し早期からALSを発症した。更に、形態学的、生化学的検討を行った結果、②SOD蛋白質の凝集を早期から運動神経軸索に認め、それに引き続いて、③ユビキチン(Ub)化蛋白質の集積、及び④オートファジーの更新を認めた。更に、⑤ALSマウスに比し脊髄運動神経の変性を早期から認めた。一方、⑥アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイトなどのグリア細胞の形態や数については、ALSマウスとATF6 KO / ALSマウスとの間で有意な差は認めなかった。これらの結果から、ALSマウスでは早期から運動神経における小胞体ストレス応答がその病態制御に重要な働きをしていることが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ATF6 KO / ALSマウスの解析は、これまでの所、順調に進行し、以下の事実を明らかにした。体重減少を指標に解析した所、①同マウスにおいてはALSマウスに比し早期からALSを発症した。更に、形態学的（免疫組織化学）、生化学的（qPCR、ウエスタンブロット）検討を行った結果、②SOD蛋白質の凝集を早期から運動神経軸索に認め、それに引き続いて、③ユビキチン(Ub)化蛋白質の集積、及び④オートファジーの更新を認めた。更に、⑤ALSマウスに比し脊髄運動神経の変性（脱落）を早期から認めた。一方、⑥アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイトなどのグリア細胞の形態や数については、ALSマウスとATF6 KO / ALSマウスとの間で有意な差は認めなかった。これらの結果から、ALSマウスでは早期から運動神経における小胞体ストレス応答がその病態制御に重要な働きをしていることが明らかになった。

今後の研究の推進方策

特に以下の点について重点的に研究を推進する。
１． 小胞体ストレス応答とG93A SOD細胞内集積：これまでの研究より、ATF6 KO / ALSマウスにおいて早期よりG93A SOD細胞内集積が起こることを確認した。今後、293細胞、及び神経芽細胞種SH-SY5Y細胞などの培養細胞を用いて、そのメカニズムを解析する。具体的にはG93A SODの過剰発現が小胞体ストレスを誘導するか、逆に、小胞体ストレスはG93A SODの集積を引き起こすかについてqPCR、ウエスタンブロット、免疫細胞化学を用いて検討する。
２．ALSマウス及びATF6 KO / ALSマウスにおける生存率：これまでの研究より、ATF6 を欠損することでALSを発症が早まることが明らかになったが、生存期間で見ると、ALSマウス及びATF6 KO / ALSに有意な差は認めなかった。その原因として、小胞体ストレス応答のうち他の経路、例えばIre1、Perk、ATF6b経路が代償しているのではないかという仮説を立て、それら経路の活性化についてqPCR、ウエスタンブロット、免疫組織化学を用いて検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Deletion of Atf6α impairs astroglial activation and enhances neuronal death after brain ischemia in mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshikawa A, Kamide T, Hashida K, Ta HM, Inahata Y, Takarada-Iemata M, Hattori T, Mori K, Takahashi R, Matsuyama T, Hayashi Y, Kitao Y, Hori O
  • 雑誌名: J Neurochem. 巻: 132(3) ページ: 342-53
  • DOI: 10.1111/jnc.12981
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Anxiety- and depression-like behavior in mice lacking the CD157/BST1 gene, a risk factor for Parkinson's disease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Lopatina O, Yoshihara T, Nishimura T, Zhong J, Akther S, Fakhrul AA, Liang M, Higashida C, Sumi K, Furuhara K, Inahata Y, Huang JJ, Koizumi K, Yokoyama S, Tsuji T, Petugina Y, Sumarokov A, Salmina AB, Hashida K, Kitao Y, Hori O, Asano M, Kitamura Y, Kozaka T, Shiba K, Zhong F, Xie MJ, Sato M, Ishihara K, Higashida H
  • 雑誌名: Front Behav Neurosci. 巻: 8 ページ: 133
  • DOI: 10.3389/fnbeh.2014.00133
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Deletion of N-myc downstream-regulated gene 2 attenuates reactive astrogliosis and inflammatory response in a mouse model of cortical stab injury. (2014)
  • 著者名/発表者名: Takarada-Iemata M, Kezuka D, Takeichi T, Ikawa M, Hattori T, Kitao Y, Hori O
  • 雑誌名: J Neurochem. 巻: 130(3) ページ: 374-87
  • DOI: 10.1111/jnc.12729
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] The effect of endoplasmic reticulum (ER) stress on STAT3-dependent astroglia l activation after stroke (2014)
  • 著者名/発表者名: 堀 修
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会 シンポジウム
  • 発表場所: 京都国際会議場（京都市）
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
  • 招待講演
• [学会発表] ATF6αの欠損は脳虚血後のアストロサイト活性化を抑制し、神経細胞死を増大させる (2014)
  • 著者名/発表者名: 堀 修
  • 学会等名: 第36回日本生物学的精神医学会 第 57 回日本神経化学会 シンポジウム
  • 発表場所: 奈良県文化会館（奈良市）
  • 年月日: 2014-09-29 – 2014-09-30
  • 招待講演
• [備考] 金沢大学医薬保健研究域医学系 神経分子標的学
  • URL: http://med03.w3.kanazawa-u.ac.jp/