| 研究課題/領域番号 |
26430090
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
斉藤 美知子 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (40379558)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 糖尿病 / 小胞体ストレス / インスリン |
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| 研究実績の概要 |
哺乳類細胞における小胞体ストレスセンサーのうちのひとつであるIRE1αの膵β細胞における機能を明らかにするため、膵β細胞特異的にIRE1αを欠失させたマウスを用い、解析を行っている。このマウスは、生後16週目あたりから血糖値の上昇が認められ、これはインスリン抵抗性のせいではなく、インスリン量の不足によるものであることがわかっている。また、糖負荷による解析で、インスリン分泌に低下が見られることもわかった。この詳細を調べるために、マウス個体ではなく細胞を用いて解析することとし、IRE1α RNase ドメインのfloxマウスと膵β細胞特異的にがん化を起こすマウスを掛け合わせたマウス膵臓より、IRE1α RNase flox の遺伝子座を持つ株化β細胞を樹立した。この細胞にアデノウイルスを用いてCreタンパク質を発現させ、IRE1α RNase ドメインを欠失した細胞を得ることができる。この細胞を用いて、インスリン分泌の低下、インスリンタンパク量の低下を確認した。この成熟型インスリンタンパク質の低下が何に起因するのかを調べるために、小胞体ストレスに関わる遺伝子群、タンパク質フォールディングに関わるシャペロン遺伝子群などの遺伝子発現解析を行ったところ、シャペロンの一部が減少していることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
IRE1α RNase ドメインのfloxマウスと膵β細胞特異的にがん化を起こすマウスを掛け合わせ、得られたマウスの膵臓より、IRE1α RNase flox の遺伝子座を持つ株化β細胞を樹立した。この細胞にアデノウイルスを用いてCreタンパク質を発現させて、loxP配列で囲まれたIRE1α RNase ドメインを欠失した細胞を得た。この樹立した細胞からRNAを抽出し、小胞体ストレス関連遺伝子とタンパク質のフォールディングに関わる遺伝子群の発現を調べた。また、放射性同位元素を取り込ませて調べたところ、翻訳に大きな差はないが、成熟過程に変化が認められた。
膵b細胞特異的にIRE1α RNaseドメインを欠失させたマウスの各週齢（８，１２，１６週）の組織学的解析を行い、血糖値上昇は膵島の数や面積の減少によるものではないことがわかった。
本学動物実験施設が空調機更新工事のため、ほぼ10ヶ月使用することができなかったため、IRE1αとATF6のダブルノックアウトの解析に関しては行うことができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
樹立したIRE1α RNaseドメイン欠失細胞において、成熟に差があることがわかってきたので、どの因子がインスリンタンパク質のフォールディングに関わっているのかを、遺伝子発現、タンパク質の発現などで確認する。因子がある程度特定できたら、その因子を細胞に導入しレスキューさせることができるのかどうか確認する。また、細胞で起こっている現象が、マウスでも起こっている現象であるのかどうか、マウス膵島を用いて遺伝子発現、タンパク質発現を確認する予定である。
IRE1αとATF6のダブルノックアウトマウスに関しては、IRE1α RNase欠損細胞と同様に、細胞株を樹立し急激な血糖値上昇が起こる原因がどこにあるのか、詳細を調べる。まずは、IRE1α シングルノックアウト細胞で確認された因子がどのように変化しているのかを調べ、さらに別の因子にも差があるのかどうかを確認する。
形態学的な差を調べるために、電子顕微鏡での観察を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、動物実験施設が空調工事のため半年間動物を飼育できない状況であり、動物実験にかかる費用が当初の予定より少なくなった。また、学会参加費用が予定よりも少なくなったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
学会参加、および動物実験関連の試薬や動物購入に充てる予定である。
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