研究課題
本研究では申請者らが分離した強力な抗SIV中和抗体B404について、その詳細な結合エピトープの同定やB404抵抗性のメカニズムの解析を行っている。昨年度に作成したアラニンへの点変異体や、糖鎖欠失変異体を用いた解析の結果、一部のEnv変異体でB404による中和活性の減少や感染性の消失がみられたものの、結合活性に大きな影響を与える変異を同定することができなかった。このため、Env変異体を用いた解析に加えて、結晶構造解析による結合エピトープの同定を行うこととした。B404抗体とEnvが結合した結晶を得るために、構造的に安定したEnvのコア部分とB404との予想結合部位で構成されたEnv変異体を作成した。今後、このEnvコア変異体を精製し、B404との結晶構造解析を進めていく。また、このEnvコア変異体は、B404類似抗体を検出するためのプローブや、B404類似抗体を誘導するための抗原として利用するために改良を加えていく。一方、B404類似抗体検索のため、B404類似抗体に特異的なPCRプライマーを用い、B404類似抗体を誘導しているSIV感染サルから抗体ライブラリを作成した。ファージ・ディスプレイ法によってSIV Envに特異的な抗体の選別を行ったところ、B404類似抗体が迅速に分離されることを確認した。しかしながら、B404類似抗体の有無が不明な感染初期のSIV感染サルの検体からは、同様の方法でB404類似抗体を分離することができなかった。得られた抗体は、B404と同じVH3グループのVH遺伝子を使用しているものが大半であったが、B404とは異なる遺伝子を使用していた。今後、さらに色々な検体からライブラリを作成してB404類似抗体の分離を行い、B404類似抗体の成熟過程やB404類似抗体の誘導頻度を解析していきたい。
2: おおむね順調に進展している
本年度はB404が認識するエピトープ解析のためのEnv変異体の解析を予定通り終了した。しかしながら、B404の結合に大きな影響を与えるアミノ酸部位を同定できなかったため、結晶構造解析によるエピトープ解析を行うこととした。このための準備として、結晶構造をとりやすい安定したEnvコア変異株の作成を行った。この計画変更により、詳細なB404のエピトープ同定は来年度以降となった。B404類似抗体の分離については、当初、SIV非感染サルから、B404と同じ抗体遺伝子、及び特異性をもつB404類似の祖先抗体を分離する予定であったが、新たにSIV感染サルの試料を得る機会を得たために昨年度より計画を変更し、今年度は感染直後の未成熟なB404類似抗体の分離を試みた。B404類似抗体に特異的なPCRプライマーを用いた抗体ライブラリ作成と、ファージ・ディスプレイ法による抗体の選別が効率的なB404類似抗体の分離法であることを確認し、実際に感染初期の試料からライブラリを作成して抗体の分離を行った。今年度の解析では、感染初期における未成熟なB404類似抗体の誘導は確認できなかったが、感染初期の試料から分離した抗体に中和活性があることを示すことができた。
本研究の目的の一つであるB404抗体のエピトープの同定がEnv変異体の解析では困難であることから、結晶構造解析によるエピトープ解析を行うこととした。今年度に作成したEnvコア変異株を用いてB404との結晶の作成と構造解析を進めていく。また、このEnvコア変異株を基に、B404類似抗体を検出するためのプローブやB404類似抗体誘導のための抗原の開発を進めていく予定である。B404類似抗体の分離については、感染初期から後期までの経時的な試料からライブラリを作成し、B404類似抗体と本年度に新たに分離した中和抗体の分離を行い、中和抗体の成熟過程を解析していく。B404類似抗体は、これまでの研究ではSIVsmH635FC感染アカゲザルで高頻度に誘導されることが示唆されていたが、B404類似抗体の有無が不明な感染初期の検体からの分離は困難であった。この結果が、B404類似抗体が誘導されていないからなのか、それともB404類似抗体が未成熟なため分離できなかったのかが不明である。今後の感染後期の解析結果によって、この点をあきらかにし、未成熟な中和抗体の分離法を再度検討していく予定である。
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