| 研究課題/領域番号 |
26430139
|
|---|
| 研究機関 | 独立行政法人国立がん研究センター |
|---|
研究代表者 |
藤井 元 独立行政法人国立がん研究センター, その他部局等(研究所), 主任研究員 (90321877)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | 遺伝子環境交互作用 / 肥満 / DNAメチル化 / ヒストン修飾 |
|---|
| 研究実績の概要 |
がんは遺伝子の病気であると共に、環境からの強い影響をうけて起こる疾患である。近年メタボリック症候群に代表されるような肥満状態は穏やかな慢性炎症というべき環境を形成しており、そこからがんが発生してくる機序が注目されている。
慢性炎症状態が惹起する細胞活性化状態だけでは、がん発生の必要条件となる遺伝子の変異頻度はかなり低いと従来考えられてきたが、最近のエピゲノミクス研究では環境変化に応じてDNAメチル化やヒストンの修飾が有意な頻度で起こりうる可能性が示されている。
そこで当研究計画では高栄養摂取により肥満状態にしたマウスや、高栄養培地での培養を行った培養細胞で、DNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるのか、を直接的／実験的に検証することを研究の具体的目的としている。
当該年度では栄養濃度の異なる様々な培地で、大腸がん由来の培養細胞や初代培養細胞に比較的近いと考えられる培養細胞などを長期間培養することから開始した。実験の基盤と成る低栄養状態培養条件の検討に予想より時間がかかってしまったが、最終的に培養可能な各種の条件を決定し、高栄養条件下でDNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が起こりうるかの検証を現在行っている。
各種栄養条件で培養を行った細胞標品は、継代を追って冷凍保存しており、或る程度の継代数をへた時点でまとめてエピジェネティクス解析を行う予定である。解析は発がん原因と成りうる遺伝子変異を惹起可能なメチル化解析を中心に行う事を予定している。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当研究計画ではまず高栄養培地での培養を行った培養細胞で、DNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるのか、の検証から開始した。栄養濃度の異なる様々な培地で、大腸がん由来の培養細胞や初代培養細胞に比較的近いと考えられる培養細胞などを長期間培養を目指したのだが、実験の基盤と成る低栄養状態培養条件下での培養で細胞が上手く増殖を行わない、等のいくつかのトラブルが発生し、この栄養条件の検討に当初の予想よりも大幅に時間がかかってしまった。
試行錯誤の結果、最終的には細胞が無事増殖できる各種培養栄養条件の決定を行う事が出来、高栄養条件下でDNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が起こりうるかの検証を、予定よりやや遅れてはいるものの、現在行っているところである。
各種栄養条件下で培養を行った培養細胞標品は、現在継代を追って冷凍保存しており、或る程度の継代数をへた時点でまとめてエピジェネティクス解析を行う予定である。
解析は発がん原因と成りうる遺伝子変異を惹起可能なメチル化解析を中心に行う事を予定しているが、同時にヒストン修飾種特異的な抗体を用いた定量法（細胞標品蛋白試料ウェスタンブロッティングからの該当ヒストン蛋白種の定量、免疫沈降産物の定量、もしくはクロマチン沈降を用いたDNAからの間接定量）などに基づいた、エピジェネティック関連蛋白の定量測定も行う事を考えている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後もまずは高栄養培地での培養を行った培養細胞で、DNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるかを実験的に確認する事を行う予定でいる。幸い培養可能な各種の条件を決定を行う事が出来、各種栄養条件で培養を行った細胞標品は、現在継代を追って冷凍保存しているため、当初計画にそう遅れる事なく遂行が可能と考えている。
また細胞レベルに加えて、個体レベルでの検証を今後の研究推進の中心課題と設定している。標準的マウス（B6やBulb）に加え、肥満マウス（KKマウスやKK-Ayマウス）の利用し、普通食、もしくは高栄養食（高脂肪食）を給餌した後、経時的に屠殺、高栄養の影響が大きそうな臓器や肥満関連がんの標的臓器となっている各種の臓器や対象となりそうな臓器（肝臓／筋肉／消化管／乳腺／脳／生殖腺など）を摘出／冷凍保存後、DNAもしくは蛋白の粗精製を行う。それぞれのDNA修飾レベル・ヒストン修飾レベルの定量解析を行い、修飾レベルの変動を精度良く測定することを予定している。
以上の細胞レベル／個体レベルのエピゲノム変化に関する答えが得られた後には1）運動介試験サンプルでのエピゲノム変動、2）個別の遺伝子座におけるエピゲノム変動の解析、を行う事を予定しているが、おそらくこれらは来年度以降の実施となるものと考えている。但し、運動介試験サンプルでのエピゲノム変動は運動＆食事介入を行ったヒトでのサンプルが必須であるため、この為の準備は遅滞せず進めておきたい。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当研究計画ではまず高栄養培地での培養を行った培養細胞で、DNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるのか、の検証から開始した。栄養濃度の異なる様々な培地で、大腸がん由来の培養細胞や初代培養細胞に比較的近いと考えられる培養細胞などを長期間培養を目指したのだが、実験の基盤と成る低栄養状態培養条件下での培養で細胞が上手く増殖を行わない、等のいくつかのトラブルが発生し、この栄養条件の検討に当初の予想よりも大幅に時間がかかってしまった。
このためH26年度の実験計画に遅れが生じ、予定していた解析系の実験までは行えなかった。但し試行錯誤の結果、現在は細胞が無事増殖できる各種培養栄養条件の決定を行う事が出来たのでH27年度より当初予定していた解析を順次行う予定である。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
H27年度はまず現在保存を進めている高栄養培地下培養細胞試料で、DNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるかの実験的測定を行う予定である。これらの解析にはプレリミナリーな検討を除いて使用出来なかったH26年度使用予定の測定系研究費を充当して行う事を想定している。
またH27年度は当該年度の予算を用いて、細胞レベルに加えて、個体レベルでのDNA修飾レベル・ヒストン修飾レベルの定量解析を行い、修飾レベルの変動を精度良く測定することを予定している。培養細胞系の実験とは全く独立して行う実験である為、動物飼育や給餌の費用に研究予算を有効利用する予定でいる。
|
