| 研究課題/領域番号 |
26430146
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
荒川 泰弘 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (80349547)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 食道癌 / 化学療法 / 効果予測 / シスプラチン / フッ化ピリミジン / タキサン |
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| 研究実績の概要 |
今回の研究目的は、ヒト遺伝子を網羅する shRNA 発現ウィルスベクタープールを高効率に、かつレパートリーを保った状態で食道癌細胞株に導入し、薬剤感受性に変化を与える遺伝子を スクリーニングすることである。ヒトゲノム全塩基配列が利用可能となった現在、ターゲットとなる遺伝子配列を狙って表現型を得る方法として RNAi は格好のツールとなっており、網羅的RNAi スク リーニングは抗癌剤感受性変化という特定の表現系に影響する遺伝子群の探索に非常に有用 であると考えられる。
食道癌由来細胞株であるKYSEシリーズをJCRB細胞バンクより入手、増殖の安定性とレンチウィルスライブラリーの導入効率からKYSE-170を本実験に使用することにした。使用するshRNA発現レンチウィルスライブラリーは、予備実験の結果からDECIPHER Lentiviral shRNA Library (27k)に決定した。レンチウィルスライブラリーを0.5 MOIでKYSE-170に感染させた後、ピューロマイシンを投与してshRNA安定発現細胞を選択した。shRNA安定発現細胞をシスプラチン10 μM存在下で72時間培養し、薬剤耐性細胞集団を得た。今後、この細胞集団からシスプラチン耐性細胞をクローニングし、各クローンよりゲノムDNAを抽出、PCRでshRNA配列を増幅およびシークエンスを行い、shRNAの標的となってノックダウンされている遺伝子を同定する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
シスプラチン耐性細胞集団のクローニングまでが予定であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
発現抑制が抗癌剤感受性をもたらす遺伝子の選別を行う。具体的には、レンチウィルスライブラリーを導入した食道癌細胞株を、抗癌剤を投与する実験用サンプルと投与しない対象サンプルに分ける。実験用サンプルに抗癌剤を投与した後、実験用サンプルと対 象サンプルの両者からゲノム DNA を抽出する。ゲノム中に挿入された shRNA 配列を PCR にて増幅 し、次世代シークエンサーを用いてシークエンスする。抗癌剤投与により増減した shRNA 配列を 対象サンプルと比較することで選別、shRNA がターゲットとする遺伝子を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の若干の遅れのため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度の遅延部分も含めて、予定されていた研究を次年度行う。
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