| 研究課題/領域番号 |
26430150
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| 研究機関 | 静岡県立静岡がんセンター（研究所） |
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研究代表者 |
大島 啓一 静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, その他 (10399587)
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| 研究分担者 |
寺島 雅典 静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, その他 (40197794)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 腫瘍マーカー / プロホルモン変換酵素 / ELISA / セクレトーム / 培養細胞 / プロテオーム / エクソーム / トランスクリプトーム |
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| 研究実績の概要 |
がんの診断学では、血中腫瘍マーカーの開発はその簡便性や低浸潤性により多大な期待感がある。本研究では、血中に分泌され、かつ安定的に存在し、ELISAで定量可能な新規腫瘍マーカーとなる物質を見出すことを目標に、生理活性ペプチド前駆体タンパク質を標的として探索を行うことを計画した。本計画の背景には、申請者らにより見出された小細胞肺癌に対する腫瘍マーカー候補物質であるニューロテンシン前駆体（proneurotensin/proneuromedin N, proNT/NMN）、ならびに既存の腫瘍マーカーであるガストリン放出ペプチド前駆体（progastrin-releasing peptide, proGRP）の存在がある。生理活性ペプチドは、前駆体タンパク質がプロセシングを受けることにより生じるが、その過程にプロホルモン変換酵素群（prohormone convertasesまたはproprotein convertases, PCs）の関与が示唆されている。こうした経緯から、本研究では、9つあるPCsの働きの違いにより、proNT/NMNやproGRPのような前駆体タンパク質が腫瘍特異的に血中に存在するのではないかと考え、PCsの活性を指標に、プロテオミクスを基盤技術として、腫瘍マーカー候補となる前駆体タンパク質を見出すことを計画した。計画2年目に当たる平成27年度では、小細胞肺癌細胞株6種、ならびに肉腫関連株20種について、PCsをはじめとした遺伝子発現のデータを取得した。これらは次年度計画するプロテオーム解析に対する基盤データとなる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究では、血中に分泌され、かつ安定的に存在し、ELISAで定量可能な新規腫瘍マーカーとなる物質を見出すことが目標である。具体的には、生理活性ペプチド前駆体タンパク質とそのプロセシングに関わるプロホルモン変換酵素群（PCs）活性に注目し、①ニューロテンシン前駆体（proNT/NMN）放出小細胞肺癌をはじめとした各種がん細胞株におけるPCsの遺伝子発現や配列解析、②proNT/NMN放出細胞株におけるPCs活性を基にした培養細胞上清液中の生理活性ペプチド前駆体タンパク質解析、③候補タンパク質に対するELISA系の確立、④マウスXenograftモデル血中における候補タンパク質の安定性の検討を計画した。平成27年度では次の3つの計画を予定した。
1)がん細胞株におけるPCs の発現及び遺伝子変異の状態の確定。proNT/NMN細胞外分泌性が明らかな小細胞肺癌細胞株6株（陽性・陰性各3株）に加えて、肉腫細胞株20種についてマイクロアレイによる遺伝子発現データを得た。また、公共DB（CCLE, expO）を参考に、それぞれ細胞株と腫瘍における発現データを検討した。
2)細胞株におけるproNT/NMNの細胞外分泌性と発現状態の関連性の検討。これらの関連性からプロテオーム解析用の細胞株を選択する計画である。検討中の段階である。
3)がん細胞の培養上清中に分泌されるタンパク質のプロテオーム解析。発現とproNT/NMN細胞外分泌の関連性から絞り込んだがん細胞株について、培養上清液画分に含まれるタンパク質のプロテオーム解析を行う計画である。本解析は、質量分析装置の更新時期と重なったため、あえて古い装置（Hitachi NanoFrontier）での分析を行わず、次年度に高スペックな新しい装置（Thermo Fisher Scientific Q Exactive HF）で行うことにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度までに小細胞肺癌細胞株6種、ならびに肉腫を中心とした他のがん細胞株におけるプロホルモン変換酵素群（PCs）9種の発現データを取得した。一方、小細胞肺癌細胞株6種の遺伝子配列の解析、ならびにプロテオーム解析は未着手の状態である。それ故、最終年度（平成28年度）では、腫瘍マーカー候補を見出すため、以下に示す3つを計画する。
第一目標は、小細胞肺癌細胞株6種の遺伝子配列の解析である。これらのエクソーム解析を行い、特にPCs遺伝子上の変異と分泌タンパク質の遺伝子発現について詳細に検討する。第二の目標は、上記の遺伝子発現と変異解析の結果から選択した細胞株について、培養上清液中のタンパク質・ペプチドをプロテオーム解析により同定する。第三の目標は、プロテオーム解析から腫瘍マーカー候補タンパク質を抽出し、同定実験としてウェスタンブロッティング用市販抗体の入手、抗体の作製とELISA系の確立、ならびにマウスxenograftモデルの作製を行う計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度（平成27年度）では、がん細胞株におけるプロホルモン変換酵素群（PCs） 遺伝子の変異解析、ならびに培養細胞を用いたプロテオーム実験に対して、当初の計画より「遅れ」が生じた結果となってしまった。従って、それらの実験に関わる費用を次年度（平成28年度）に持ち越すことになった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度（平成28年度）では、昨年度（平成27年度）までに目標を達成できなかった遺伝子配列解析実験、ならびに培養細胞におけるプロテオーム解析を年度前半に行う計画である。その後、腫瘍マーカー候補タンパク質を選び出し、年度後半にその実証実験を行う計画である。従って、研究費の請求は、遺伝子配列解析としてエクソーム解析費用、プロテオーム解析費用、ならびに実証実験に対する抗体やマウス購入費用に対して行う。また、当初の計画通り、学会誌への論文投稿用費用として、論文校閲費、論文掲載費及び論文別刷費、加えて、国内学会における発表に対する出張費を申請する。
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