| 研究課題/領域番号 |
26430169
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
北里 英郎 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (90195256)
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| 研究分担者 |
中村 正樹 北里大学, 医療衛生学部, 助教 (30724554)
片桐 真人 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (50152674)
馬嶋 正隆 北里大学, 医学部, 教授 (70181641)
松本 和将 北里大学, 医学部, 講師 (70306603)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | インターロイキン24 / 細胞治療 |
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| 研究実績の概要 |
1.遺伝子改変細胞C57-mIL-24の作製と抗腫瘍効果の評価
MBL社にmouse IL-24遺伝子の人工合成を依頼し、レトロウイルスベクターpDon-5 Neoにクローニングを行い（pDon-mIL-24）、PT67細胞にトランスフェクションした。この細胞上清中に産生される組み換えレトロウイルスを、C57細胞に感染させ、G418で選択を行い、遺伝子改変細胞C57-mIL-24を5クローン作製した。C57-mIL-24細胞クローンよりそれぞれtotal RNAを抽出し、real time PCRを用いてIL-24遺伝子発現量を測定し、最も発現量の高いクローンを選別した。また抗mouse IL-24抗体を用いたウェスタンブロット法により、mIL-24蛋白を検出した。mIL-24の抗腫瘍効果を評価するため、in vitroにおいて、マウスメラノーマB16細胞にてMTTアッセイを行った。C57-mIL-24細胞の培養上清を添加したが、B16細胞の増殖に有意な変化が認められなかった。
2.遺伝子改変細胞C57-IL-24の作製
mouse IL-24において抗腫瘍効果が認められなかったことから、メラノーマや前立腺癌を初め複数の腫瘍において抗腫瘍効果が報告されている、human IL-24遺伝子を用いることとした。mIL-24遺伝子と同様に、MBL社にhuman IL-24遺伝子の人工合成を依頼し、レトロウイルスベクターにクローニングを行い、PT67細胞にトランスフェクションした。この細胞上清中に産生される組み換えレトロウイルスをC57細胞に感染させ、G418で選択を行い、遺伝子改変細胞C57-IL-24を5クローン作製した。C57-IL-24細胞クローンよりそれぞれtotal RNAを抽出し、real time PCRを用いてIL-24遺伝子発現量を測定し、最も発現量の高いクローンを選別した。
3.学会発表
中村綾香、香川理紗、前花祥太郎、中村正樹、北里英郎：IL-24産生遺伝子改変細胞を用いた悪性黒色腫に対する抗腫瘍効果の検討：第35回日本炎症・再生医学会．2014
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成26年度の研究実施計画のうち遺伝子改変細胞C57-mIL-24及び対照であるC57-EVの作製を行った。マウスメラノーマ細胞B16への抗腫瘍効果を検討したが、有意差が認めら得なかったことから、human Il-24遺伝子からC57-IL-24を作製した。LLC-IL-24細胞は現在作成中である。またC57-IL-24におけるIL-24蛋白発現の確認実験をELISA法にて確認中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.C57-IL-24細胞の産生する分泌蛋白質の確認及びLLC-IL-24細胞の作製
昨年度作製したC57-IL-24の細胞上清を回収し、産生される分泌蛋白を、ELISA法にて測定する。またLLC-IL-24細胞についてもC57-IL-24同様に、real time PCR及びELISA法を用いてIL-24遺伝子発現を確認する。
2.IL-24の抗腫瘍効果の確認
C57-IL-24、LLC-IL-24におけるアポトーシス誘導をcell death ELISA法により確認する。またアポトーシス関連蛋白をCASPASE、BAXを中心にwestern blot法にて確認する。対象としてC57-EV及びLLC-EVをそれぞれ用いる。
3.In vivoにおけるIL-24抗腫瘍効果の検討
C57/ BL/ 6マウス皮下に、LLC細胞とC57-IL-24細胞とをtotal 100μl PBS中に混和の後、移入し、細胞療法を実施する。細胞移入後21日後に原発巣での抗腫瘍効果を検討する。原発巣はアポトーシス誘導をTUNEL染色、血管新生およびリンパ管新生を抗CD31抗体と抗lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor - 1 （LYVE-1）抗体を用いて解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２６年度は、Mouse IL-24産生遺伝子改変細胞を作製したが、既知の論文から予測された、抗腫瘍効果が期待できない、実験結果であったため、Human IL-24産生遺伝子改変細胞を作製した。この細胞の、In vitroにおける抗腫瘍効果検討のため、研究費を繰り越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
Human IL-24産生遺伝子改変細胞の蛋白量測定のために使用予定である。
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