| 研究課題/領域番号 |
26430185
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
菊池 裕 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (20286438)
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| 研究分担者 |
穂積 俊矢 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (10597222)
武藤 彰彦 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (70589366)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ゼブラフィッシュ / 再生 / トランスクリプトーム |
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| 研究実績の概要 |
＜尾ビレ再生時の脱分化細胞で特異的に発現する遺伝子のスクリーニング＞
本研究課題では、ゼブラフィッシュ尾ビレ再生時に観察される脱分化機構の解明を研究目的としている。この目的を達成するため、翻訳リボソーム親和性精製法 (Translating Ribosome Affinity Purification; TRAP)を用いることにより、脱分化細胞で特異的に発現する遺伝子を次世代シークエンサーにより単離し、脱分化に機能する遺伝子を明らかにする事を目指している。本年度は、昨年度に引き続き脱分化細胞をGFP蛍光でラベルするため、elongation factor 1a (ef1a)遺伝子のプロモーターで、EGFP-ribosomal protein L10a（EGFP-rpl10a）遺伝子をコントロールさせたトランスジェニックフィッシュ（Tg[ef1a:EGFP-rpl10a]）の作製を継続して行った。更にこのトランスジェニックフィッシュの再生芽から、GFP蛍光を指標にして脱分化細胞を集め、再生芽の脱分化細胞特異的に発現している遺伝子の単離を行っている。
＜新規尾ビレ再生制御機能の解析＞
私達は、ゼブラフィッシュ尾ビレ再生過程における脱分化は、Mechanistic target of rapamycin complex 1（mTORC1）により制御される事を新たに見出した。更にこのmTORC1は、インスリン様成長因子1受容体（Insulin- like growth factor-1 receptor: IGFR）・ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（Phosphatidylinositol-3 kinase: PI3K）経路及びcanonical Wnt経路の下流に位置する事を明らかにし、論文発表（BMC Developmental Biology 2014;14(1):42.）を行った。本研究成果を基に、私達はmTORC1に制御される因子・遺伝子の探索を研究目的にとして、ドラックスクリーニングや遺伝子発現解析を行った。その結果、再生が進むと共に特定の受容体遺伝子の発現が減少する事、再生尾ビレでその受容体経路を活性化させると、mTORC1シグナルの活性化が起こる事を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ゼブラフィッシュの尾ビレ再生を実験系として、脱分化細胞で特異的に発現する遺伝子のスクリーニング及び、その遺伝子機能を解明することが、本研究の目的である。本年度は、脱分化細胞で特異的に発現する遺伝子をスクリーニングするために用いるトランスジェニックフィッシュ（Tg[ef1a:EGFP-rpl10a]）の作製を行い、現在までに4～5系統のトランスジェニックラインを確立した。しかし、このトランスジェニックフィッシュを成体まで育て、尾ビレを切断したが、GFP蛍光が全く観察されない、或いは再生芽の一部分にのみGFP蛍光が観察される等の問題点が明らかになった。そこで、継続してトランスジェニックラインの作製を進めると共に、脱分化細胞の分離・リボソームタンパク質の精製・発現遺伝子の単離を行っている段階であることから、おおむね順調に進展していると考えている。
また、本研究申請のきっかけとなった、尾ビレ再生におけるmTORC1の機能解析に関しては、本研究費とは異なる研究費により更に詳細な実験を行った。mTORC1の下流であるS6キナーゼのリン酸化を指標に、mTORC1に制御される因子・遺伝子の探索を研究目的に、ドラックスクリーニングや遺伝子発現解析を行った。その結果、再生が進むと共に特定の受容体遺伝子の発現が減少する事、その受容体を活性化した際、mTORC1シグナルの活性化が起こる事を見出した。受容体の活性化によるゼブラフィッシュの尾ビレ再生過程を詳細に観察した結果、コントロールの尾ビレ再生より早く再生が進行していた。正常な尾ビレ再生では、切断前の大きさに戻ると再生は停止するが、長期間（3週間）活性化処理すると、切断前の尾ビレのサイズよりも大きくなる事を見出した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、本研究申請の実験計画通りに、トランスジェニックフィッシュ（Tg[ef1a:EGFP-rpl10a]）の脱分化細胞からリボソームタンパク質を精製し、発現遺伝子の単離を行う。私達が行った予備的実験結果より、精製したリボソームタンパク質から発現遺伝子の単離を行うと、通常の遺伝子発現解析よりも非常に効率が低下する（1/10以上低下）ことが明らかになった。そのため、次世代シークエンサーによる網羅的な遺伝子発現解析を行うためには、トランスジェニックゼブラフィッシュから、脱分化細胞を多量に分離しなければならず、現在この実験段階に多くの時間を費やして検討を行っている段階である。脱分化細胞から、十分な発現遺伝子を単離出来れば、それ以降の次世代シークエンサーによるスクリーニング及び遺伝子機能解析は、多くの研究実績があるため、順調に進めることが出来ると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究申請書に記載の通り、作年度は翻訳リボソーム親和性精製法 (Translating Ribosome Affinity Purification; TRAP)を用いた遺伝子のスクリーニングを行うため、トランスジェニックフィッシュ（Tg[ef1a:EGFP-rpl10a]）の作製・脱分化細胞からリボソームタンパク質の精製・発現遺伝子の単離を中心に実験を行った。小規模の予備実験を中心に行ったため、使う研究費は少なくて済むことから次年度の使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
“今後の推進方策”にも記載の通り、次年度ではトランスジェニックフィッシュ（Tg[ef1a:EGFP-rpl10a]）の脱分化細胞からリボソームタンパク質・発現遺伝子を単離し、次世代シークエンサーによる網羅的な遺伝子発現解析を行う。このトランスクリプトーム解析には、多量の脱分化細胞・タンパク質の単離が必要になる事が予想される。そのため、次年度の研究費は、リボソームタンパク質・発現遺伝子の単離・次世代シークエンサー及びデーターの解析等に使用する予定である。
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