高温ストレス下で光合成機能を維持する化合物の同定とその作用機構の解析

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26430191
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 明賀 史純 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (10342859)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 植物ゲノム / 葉緑体 / 光合成 / 高温ストレス / シロイヌナズナ

研究実績の概要

本研究は植物の高温ストレスに対する適応機構の解明と高温下での光合成機能維持の付与を目的とする。クロロフィル蛍光を指標としたハイスループットなケミカルスクリーニングを行い、高温ストレスが及ぼす光合成電子伝達への負の影響を抑制する天然化合物の同定を目指す。前年度に試みとして行った約80種類の標準化合物による第一段目のスクリーニングを終えて、本年度はさらに化合物数を増やした約400種類のパイロットライブラリーを用いた第二段目のスクリーニングを行った。96穴マルチタイタープレートの各ウェルに異なる化合物を加えた植物育成寒天培地上で育てたシロイヌナズナ幼植物体を光照射下で3時間高温ストレス処理（38℃と41℃）を行った後、二次元クロロフィル蛍光測定装置を用いてクロロフィル蛍光のクエンチング解析を行った。その結果、化合物無しのコントロールと比べて高温ストレス下で光合成機能の低下を抑制する4つの化合物とストレスがない条件下でも光合成電子伝達を強力に阻害する2つの化合物を得た。次に高温による抑制活性が化合物濃度依存であることを確認した。しかし光合成機能の低下をする4つの化合物の抑制活性はかなり弱く、より抑制活性を持つ化合物を同定する必要がある。そこでそれらの化合物が所属するグループの中の構造的に類縁な化合物を用いての活性試験を行っている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究計画書で記載した年度計画に則り、前年度には少数のRIKEN NPDepoの標準化合物ライブラリーを用いた植物体のケミカルスクリーニングを開始し、シロイヌナズナ幼植物体の高温ストレスの影響を調べるために温度条件を検討し最適条件および観察するべき光合成パラメーターを決定した。本年度はさらにそれを進めて化合物ライブラリーの数を増やしてCCDカメラによる二次元クロロフィル蛍光測定を用いたスクリーニングにより速やかに1次スクリーニングを行うことが出来た。これにより得られたいくつかの候補化合物の2次スクリーニング、および化合物の活性の濃度依存性を調べて、これを終えている。さらに候補化合物よりも活性の高い化合物を探索するために候補化合物の構造を元にその類縁体を調べて手に入れている。

今後の研究の推進方策

現在候補化合物が所属するグループの中の類縁化合物を用いて活性試験を行う予定である。複数回で連続して目的の活性を持つ化合物を絞り込む予定である。その後ヒット化合物が影響を与える光合成電子伝達系の詳細な標的部位をDual-PAMクロロフィル蛍光測定装置(Waltz社)を用いて解析し、化合物による光合成の阻害が光化学系Ⅱで起こるのか光化学系Ⅰで起こるのかそれともさらに下流で起こるのかを調べる。それと同時にRNAブロットにより高温ストレス下での化合物の添加の有無による光合成蛋白質の転写産物の蓄積変化を調べる。また葉緑体チラコイド膜タンパク質を抽出し、BN-PAGEによる光合成蛋白質複合体の解析やPSI-A/B, D1, Lhca1, Lhcb1, Cyt f, CF1-α, OE23, OE33などの光合成蛋白質の特異抗体を用いたイムノブロットを行い、高温ストレス下での化合物の添加の有無による光合成蛋白質の蓄積変化を調べる。これにより光合成電子伝達系路上の化合物の標的となっているタンパク質または代謝物を推測する。

次年度使用額が生じた理由

今年度中に光合成関連抗体を用いたイムノブロットをする予定であったがケミカルスクリーニングに予想以上に時間がかかってしまったことから物品費を節約できたために次年度への繰越額がごく少額生じた。

次年度使用額の使用計画

次年度には、類縁化合物の購入費や化合物の作用機序を調べるための葉緑体のチラコイド膜蛋白質の機能解析に必要な蛋白質抽出試薬、電気泳動用試薬、イムノブロット用試薬などの消耗品を購入する。その他経費は英文校閲費用や論文の投稿料に使用する。

研究成果

• [雑誌論文] SNAC-As, stress-responsive NAC transcription factors, mediate ABA-inducible leaf senescence. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takasaki H, Maruyama K, Takahashi F, Fujita M, Yoshida T, Nakashima K, Myouga F, Toyooka K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K
  • 雑誌名: Plant J. 巻: 84 ページ: 1114-1123
  • DOI: 10.1111/tpj.13067
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Chlorophyll Fluorescence Measurements in Arabidopsis Plants Using a Pulse-amplitude-modulated (PAM) Fluorometer. (2015)
  • 著者名/発表者名: Motohashi R, Myouga F
  • 雑誌名: Bio-protocol 巻: 5 ページ: e1464
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Arabidopsis Metabolome Analysis Using Infusion ESI FT-ICR/MS. (2015)
  • 著者名/発表者名: Motohashi R, Satou M, Myouga F, Oikawa A and Ohta D
  • 雑誌名: Bio-protocol 巻: 5 ページ: e1463
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Landscape of lipidome and transcriptome under heat stress in Arabidopsis thaliana. (2015)
  • 著者名/発表者名: Higashi Y, Okazaki Y, Myouga F, Shinozaki K, Saito K
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 ページ: 10533
  • DOI: 10.1038/srep10533
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Identification of the chemical compounds that help prevent thermal damage of electron transport in photosynthesis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Myouga F, Shinozaki K
  • 学会等名: The 57th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists.
  • 発表場所: Iwate University, Morioka, Japan
  • 年月日: 2016-03-18 – 2016-03-20
• [学会発表] Functional analysis of new chloroplast proteins using delayed fluorescence in Arabidopsis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Motohashi R, Sakai A, Fukazawa C, Myouga F, Shinozaki K, Takeuchi A, Katsumata M
  • 学会等名: The 57th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists.
  • 発表場所: Iwate University, Morioka, Japan
  • 年月日: 2016-03-18 – 2016-03-20
• [学会発表] Identification of the chemical compounds which alleviates thermal damage of photosynthetic electron-transport systems. (2015)
  • 著者名/発表者名: Myouga F, Shinozaki K
  • 学会等名: 11th International Congress of Plant Molecular Biology.
  • 発表場所: Bourbon Cataratas Convention & Spa Resort, Iguazú Falls, Brazil
  • 年月日: 2015-10-25 – 2015-10-30
  • 国際学会
• [備考] 機能開発研究グループホームページ
  • URL: http://genediscovery.riken.jp/