| 研究課題/領域番号 |
26440013
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
凌 楓 独立行政法人理化学研究所, 吉田化学遺伝学研究室, 専任研究員 (70281665)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 出芽酵母 / ミトコンドリアDNA / 細胞周期 / チェック・ポイント活性化 / 相同DNA対合 / 活性酸素種 / ROSスカンベンジャー / ５’ー３’エキソヌクレアーゼ |
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| 研究実績の概要 |
出芽酵母とヒト細胞においてよく保存されているチェック・ポイント経路(出芽酵母ではMec1/Rad53; ヒト細胞ではATM/Chk2)の活性化がミトコンドリアDNA(mtDNA)のコピー数の増加をもたらすことが知られているが、mtDNAの複製を活性化する機構が依然不明である。
本年度我々は、出芽酵母においてRRM3遺伝子とリボヌクレオシド三リン酸(NTP)からdNTPへの変換を触媒するRNRのインヒビターであるSml1をコードする遺伝子のいずれかを破壊すると、mtDNAのコピー数がMhr1、或はDin7に依存して増加することを見出した。また、ROSスカンベンジャーを含む培地で出芽酵母を培養すると、チェック・ポイント活性化によるミトコンドリアDNAコピー数の増加が抑えられた。これはチェック・ポイントを活性化したHeLa細胞での観察結果と類似している。さらに、細胞周期のチェック・ポイントに働くセリン・スレオニンキナーゼをコードするDUN1遺伝子を破壊するとチェック・ポイント活性化によるmtDNAコピー数増加が顕著に増加した。これは、Din7の発現抑制に働くDun1が、チェック・ポイント活性化の際、Din7の発現促進に転じ、mtDNAコピー数の増加に寄与することと、Sml1の有無によるdNTPプールのレベル変動に依存せず、チェック・ポイント活性化によるDin7の発現量の増加だけでもミトコンドリアDNAコピー数が増加することを示唆している。以上の結果から、チェック・ポイント活性化によるmtDNAコピー数の増加にMhr1を介したmtDNA複製が働くことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定通り、チェック・ポイント活性化によるミトコンドリアDNA (mtDNA)コピー数の増加の背後にある仕組みを明らかにしました。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は、出芽酵母とヒト細胞においてよく保存されているチェック・ポイント経路の活性化がミトコンドリアDNA(mtDNA)コピー数の増加をもたらすmtDNA複製を活性化する機構とその意義についてを解明することを研究目的とする。これまでにチェック・ポイント活性化によるミトコンドリアの組換え酵素を介したmtDNA複製の活性化機構を解析するために同定したミトコンドリアDNAの複製活性化に寄与する遺伝子の破壊株を用いて、核DNA損傷が起きた際、mtDNAコピー数に依存するミトコンドリアによるATPの合成能とATPを必要とする核DNA損傷修復にmtDNA複製が盛んになる意義を追求することでmtDNAの複製活性化の重要性を明らかにして行く。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
チェックポイント活性化によるミトコンドリアDNA(mtDNA)のコピー数の増加に関わる遺伝子にカナマイシン耐性遺伝子を組換え技術で導入し、種々の遺伝子破壊株を構築する研究に遅れが生じ、目的の標的遺伝子にカナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片をPCRで増幅する際に使うプライマーの購入を延期したため。予定していた物品プライマーの購入に充てる。
出芽酵母とヒト細胞においてよく保存されているチェック・ポイント経路(出芽酵母ではMec1/Rad53; ヒト細胞ではATM/Chk2)の活性化がmtDNAのコピー数の増加をもたらすことが知られているが、mtDNAの複製を活性化する意義は不明である。mtDNAコピー数と、DNA複製と障害チェックポイント信号による核DNA複製中間体の量的変化、及び細胞周期の進行との相関関係を明らかにする必要はある。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ミトコンドリアDNA(mtDNA)コピー数の増減がもつ生理学的な意義を明らかにするために、以下のように研究を進める。
mtDNAコピー数増大に伴う呼吸鎖複合体のmtDNAがコードするタンパク質サブユニットの量、及び核染色体DNAがコードする呼吸鎖複合体のタンパク質サブユニット量の変化をmtDNAコードのタンパク質サブユニットを指標として調べる。(2) mtDNAコピー数の増減に応じて呼吸鎖複合体の構成状態を解析する。(3)生産されたATPを測定することで、mtDNAコピー数と、呼吸鎖複合体を構成するタンパク質サブユニット量の変化、及び構成状態との相関関係を明らかにする。 (4) ARSをもつrDNAの領域におけるY字型DNA複製フォークの量の変化を調べる。(5) フローサイトメトリーを用いて細胞周期の進行状況を観察する。
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