| 研究課題/領域番号 |
26440017
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (90207267)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | カルシウムポンプ / Ca / 能動輸送 / nanodisc / エネルギー / 酵素 / P型 / ATPase |
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| 研究実績の概要 |
小胞体CaポンプはATP加水分解に共役してCa2+を輸送し、その反応はリン酸化中間体(EP)の形成と分解を経由する。その反応機構は触媒部位を持つ細胞質ドメインA、P、NとCa2+輸送部位をもつ膜ドメインの間で構造変化の相互伝達であり、EP異性化ではCa2+が内腔へ放出される。
ヘリックスM2は膜貫通部分（M2m）と細胞質部分（M2cyt）に概ね区別され、M2cytの先端はjunctionループを介してAドメインに繋がっている。M2はCa輸送反応中大きく構造変化するがその意義は不明であった。そこでこれらの領域に、5個のGlyを挿入（5Gi；伸長とヘリックスの局所的破壊）してその影響を調べた。これより、特にCa2+輸送活性はM2mおよびjunctionへの5Giによりほぼ完全に阻害され、脱共役した。これより、反応段階に応じてM2の各領域およびjunctionの2次構造や長さが変化することが、細胞質領域と膜ドメイン間の構造変化を介した相互応答によるエネルギー共役に必須であり、EPの異性化、加水分解、Ca2+-gatingに重要であることを示した（Daiho et al.JBC 2015）。
次にCa-ATPase活性を保持した状態でCaポンプをnanodiscに組み込みこむ系を確立した。そこで、nanodisc中の脂質をPOPCから電荷の少ないPOPGや電荷の変わらないPOPEに変えたところ、EP異性化の速度が大きく低下した。さらに、イオン強度を変化させることにより、POPGでの活性の低下は脂質ヘッドグループの電荷変化によること、またPOPEでの活性低下は脂質とCaポンプ間の非静電的相互作用によることが明らかとなった。従って、EP異性化では塩基性ヘッドグループの正電荷が促進的に働くこと、またPEはCaポンプに作用して活性に影響を与えることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、CaポンプのCa2+輸送において、触媒部位を持つ細胞質ドメインとCa2+輸送部位をもつ膜ドメインの間で如何に相互応答が行われるかを解明することであった。筆者は両者を繋ぐlinkerのうちAドメイン/M2-linkerに着目し、それを構成する各領域が如何にはたらいて構造変化が伝達されるかを部位特異的変異導入および速度論的解析により解明した。このとき、上記linkerは反応段階に応じて膜ドメインCa2+-gateを正しく開閉させることに重要であることを示した。また、蛍光ラベルをCaポンプに取り込ませ、低いノイズ環境でFRETなど蛍光・光学的測定による機能の評価を行うため、Ca-ATPase活性を保持した状態でCaポンプをナノディスクに組み込みこむ系を確立した。さらに、Caポンプを蛍光試薬で特異的残基にラベルする条件を検討し、その系を確立した。従って、概ね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、EP異性化/Ca2+放出(Ca2E1P→ E2P + 2Ca2+in)において、細胞質ドメインの構造変化が細胞質側のAドメインと膜ドメインヘリックスM1を繋ぐA/M2-linker、M2の働きを介して如何に膜ドメインに伝達されるかについて、変異体を用いて調べる。両ドメインの相対的位置変化に着目し、EP異性化で起こる構造変化（両ドメインの相対位置変化やヘリックスの配置変化など）について、FRETを含む蛍光測定、プロテアーゼ感受性などによって調べる。
このために、平成26年度に確立したnanodisc測定系、蛍光測定系を用いて、Aドメイン/M2-linkerおよびM2の変異体について構造解析および機能解析を実施する。すなわち、EP異性化/Ca2+放出(Ca2E1P→ E2P + 2Ca2+in)において、細胞質ドメインの構造変化がこれらlinker、M2の働きを介して如何に膜ドメインに伝達されるかについて調べる。このとき、プロテアーゼ特異的切断に対する抵抗性で細胞質ドメインやM2の集合状態をモニターする。また、細胞質ドメインの集合状態をモニターするためにADP感受性を測定する。膜filtration法でEPへのCa2+閉塞量、EPへのCa2+結合親和性を測定する。これらの結果に基づき、細胞質ドメインの構造変化が、これらのlinkersを介して如何に膜ドメインの構造を変化させCa2+を放出するかを調べ、エネルギー共役機構におけるlinkersの役割について考察・推察する。また、Ca2*E2Pアナログ結晶化にも着手する。
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