| 研究課題/領域番号 |
26440024
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
谷 一寿 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 特任教授 (20541204)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 構造生理学 / 電子線結晶学 / 二次元結晶 / アクアポリン-4 / 極低温電子顕微鏡 / 水透過機構 |
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| 研究実績の概要 |
（Ａ）脳における水チャネルaquaprin-4(ＡＱＰ４)特有な水透過機構の解明：脱炭酸酵素の阻害剤であるアセタゾラミド(AZA)を用いてもＡＱＰ４の水透過活性を下げられることが知られているため、ＡＺＡと結合したＡＱＰ４二次元結晶を作製し、極低温電子顕微鏡像を用いて二次元結晶の実像を収集することで、5Å分解能の立体構造解析を行った。三次元再構成像からは、明瞭な膜貫通へリックスを観察することができただけでなく、細胞外側でのAZAの結合位置に関してもおおよそ特定することができた。また、リガンドドッキングシミュレーションと組み合わせることで、エネルギー的に安定な複数のリガンドドッキングポーズを提示できた。シミュレーションによるリガンドの予想結合位置および観察されたデンシティは一致し、直接ポアを塞ぐ位置にあるため、AZAがAQP4の水透過を抑制しているという実験結果と一致した。
（Ｂ）アストロサイトのエンドフィートでみられるＡＱＰ４のアレイ形成および調節機構の解明：極低温電子顕微鏡像を用いた三次元再構成の場合だけ、アレイ形成に重要なＮ末端側のデンシティが確認されていることから、従来のフィルムより高い分解能の二次元結晶の実像を収集できるようなデータ収集システム構築を試みた。その際、最近脚光を浴びている直接電子をカウントできる記録装置（Gatan社のK2 Summit）を効率よく使用できるように、コントロールＰＣ上でモーション補正プログラムを起動できるようＧＵＩ（グラフィックユーザーインターフェース）ベースのシステム開発を行った。最適な条件を探すことによって、３万倍の倍率で３Å分解能程度の実像をリアルタイムで記録できるようになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
コントロールＰＣを用いて、直接電子をカウントできるK2 Summitによって高分解能の画像を記録し、併せてモーション補正プログラムの適用も可能になったおかげで、ナイキスト周波数限界以上の分解能をリアルタイムで画像収集することが可能となった。この開発したシステムを用いることで、実像による三次元再構成の高分解能化計画が進展した。また、これまでＡＺＡのＡＱＰ４に対する阻害作用に関して長らく議論が続いていため、阻害剤であるＡＺＡがＡＱＰ４に結合した状態を可視化することができた意義は大きい。
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| 今後の研究の推進方策 |
水透過阻害状態としてのＡＺＡ結合型ＡＱＰ４を５Å分解能で決定し、阻害剤の結合部位をおおまかに特定できた。ＡＺＡ結合に伴うコンフォメーション変化は観察することができなかったが、今後の原子分解能での構造解析を遂行することで、より詳細な情報を得ることでドラッグデザインのために役立てられる可能性がある。本年度実施した結晶化の実験結果からは、ＡＺＡは二次元結晶性に大幅に影響しないことから、最終的に3.0Å分解能程度の構造解析が期待できる。今後の原子分解能モデルによってＡＺＡによる阻害機構が原子レベルで解明されるだけでなく、同じ水チャネルの仲間であるＡＱＰ１には結合しないといった特異的な結合性についても考察を行いたい。更に、ＡＺＡのメチル誘導体であるメタゾラミド（ＭＺＡ）では、ＡＱＰ４を阻害できないこともわかっているので、ＡＺＡの詳細な立体結合状態が可視化できれば、メチル誘導体によって結合できなくなる理由も説明することができ、ＡＱＰ４に対してより高いアフィニティを持つリード化合物設計のガイドになると考えている。
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