ウィルスによるヒト抗ウィルス酵素の作用阻止機構の解明と創薬に向けた分子基盤の構築

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26440026
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 永田 崇 京都大学, エネルギー理工学研究所, 准教授 (10415250)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: APOBEC / NMR / Vif

研究実績の概要

抗HIV1因子APOBEC 3G（A3G）は、一本鎖DNA（ssDNA）上のシチジンを脱アミノ化してウラシルに変換するシチジン脱アミノ化酵素である。A3GはHIV1のRNA遺伝子から逆転写により生成したssDNA上のCCCをCCUに変換することでHIV1を無毒化する。一方HIV1は、このA3Gを特異的にユビキチン化してプロテアソーム分解に導くVif蛋白質を持つ。Vifは宿主のEloB/C、CBFβ、Cul5とVif複合体を形成することでA3GのN端側ドメインに特異的に結合する。我々は昨年度、Vif複合体がA3GのC端側ドメインの酵素活性をも阻害する効果があることを新たに見出した。今年度は、Vif複合体または、各構成タンパク質と、ssDNAとの相互作用をゲルシフトアッセイ及び蛍光偏光解消法により調べた。また、Vif複合体とA3Gの相互作用について、ゲルろ過及びNMR法により調べた。得られた知見により我々は、Vif複合体によるA3Gの抗HIV活性阻害について、新たな経路を提案するに至った。
他方、別の抗HIV1因子であるAPOBEC 3F（A3F）では、C端側ドメインにシチジン脱アミノ化活性がある。A3FはssDNA上、TC配列のシチジンを脱アミノ化してTU配列に変換する。今年度は、配列の異なる種々のssDNAに対してウラシルグリコシラーゼアッセイ（UDGアッセイ）を行い、A3Fの活性を調べた。そして、A3FがTTCA配列のシチジンを好んで脱アミノ化することがわかった。またA3Fの種々の点突然変異体について、シチジン脱アミノ化活性（UDGアッセイ）及びssDNAとの結合活性（ゲルシフトアッセイ、蛍光偏光解消法）を調べ、これらの活性に関わる部位を同定した。これらにより、A3Fによる抗HIV活性の発現機構に関して新たな知見を得た。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

Vifは宿主のEloB/EloC、CBFβ、Cul5とVif複合体を形成することでA3GのN端側ドメインに特異的に結合する。昨年度は、Vif複合体がA3GのC端側ドメイン（CTD）の酵素活性を阻害する効果があることを新たに見出した。そこで今年度は、まず、Vif複合体または、各構成タンパク質と、ssDNAとの相互作用をゲルシフトアッセイ及び蛍光偏光解消法により調べた。その結果、Vif複合体は比較的強くssDNAと結合すること、一方Vifを除く各構成タンパク質とssDNAとの相互作用は非常に弱いことがわかった。Vifは単独では溶解度が低いためssDNAとの相互作用を調べることが出来なかったが、Vif複合体とssDNAの親和性の多くはVifが担っているものと思われる。また、Vif複合体とA3G-CTDの相互作用について、ゲルろ過及びNMR法により調べた。その結果、Vif複合体はA3G-CTDと弱くではあるが直接結合することが明らかとなった。現在NMR法により結合部位の同定を進めている。
これまで、Vif複合体に対するRNAアプタマーの取得に向けて、SELEX法の条件検討を行ってきた。今年度は、RNAアプタマーの候補を取ることが出来たので、配列や結合能の解析を目下進めている。
A3FのCTDについては今年度、ウラシルグリコシラーゼアッセイ（UDGアッセイ）により種々の条件で活性を調べた。そして、A3FがTTCA配列のシチジンを好んで脱アミノ化すること、活性にはpH依存性及びssDNAの長さ依存性があること等を明らかにした。またA3Fの種々の点突然変異体について、シチジン脱アミノ化活性（UDGアッセイ）及びssDNAとの結合活性（ゲルシフトアッセイ、蛍光偏光解消法）を調べ、これらの活性に関わる部位を同定した。これらの知見について、目下論文を作成するとともに、追加実験を進めている。

今後の研究の推進方策

これまで、Vif複合体に対するRNAアプタマーの取得に向けてSELEX法の条件検討を行ってきた。今年度はRNAアプタマーの候補を得ることが出来たので、配列や結合能の解析を進めており、それによりVif複合体に対する非特異的なRNA結合を抑えるための条件が明らかとなってきた。今後は、これまでに蓄積された知見を発展させて、さらに特異性及び結合能の高いRNAアプタマーを取得する。
一方、Vif複合体中のVifのみを15N標識化することに成功し、NMRスペクトルを得たが、著しく少ない数のシグナルしか得ることが出来なかった。これは分子量が大きいためだと考えられるので、今後は、Vif複合体中の非交換性水素原子を重水素原子に置換するとともに、Vifのみを15N標識化する。この試料を用いて15N-1H TROSYスペクトルを測定すれば、より感度高く15N-1H相関シグナルが得られると期待される。
今後はさらに、上の安定同位体標識化Vif複合体と非標識A3G CTD、A3F CTD、またはRNAアプタマーを使ってケミカルシフトパーターベーションを行い、Vif上の結合部位の同定を試みる。

次年度使用額が生じた理由

Vif複合体に対するRNAアプタマーの取得に向けてSELEX法の条件検討を行ってきた。今年度はRNAアプタマーの候補を得ることが出来たので、配列や結合能の解析を進めており、それによりVif複合体に対する非特異的なRNA結合を抑えるための条件が明らかとなってきた。したがって、これまでに蓄積された知見を発展させて、さらに特異性及び結合能の高いRNAアプタマーを取得することに計画を変更した。A3Fについては現在論文作成を進めており、追加実験を含め、必要なデータを得ているところである。Vif複合体の安定同位体標識化については、重水素化を行う必要があることがわかった。以上を次年度に行うため未使用額が生じた。

次年度使用額の使用計画

Vif複合体に対してより特異的で且つ高親和性のRNAアプタマーを取得する。A3Fについて蓄積したデータに、さらに追加データを集め、論文を完成させ投稿する。Vif複合体、得られたRNAアプタマーを安定同位体標識し、構造、機能解析を行う。未使用額は、これらの経費に充てることにしたい。

研究成果

• [国際共同研究] National Institute of Health/Kansas State University/UCSF(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: National Institute of Health/Kansas State University/UCSF
  • 他の機関数: 1
• [国際共同研究] ETH Zurich(Switzerland)
  • 国名: スイス
  • 外国機関名: ETH Zurich
• [国際共同研究] Universite Laval(Canada)
  • 国名: カナダ
  • 外国機関名: Universite Laval
• [雑誌論文] Molecular Landscape of the Ribosome Pre-initiation Complex during mRNA Scanning: Structural Role for eIF3c and Its Control by eIF5 (2017)
  • 著者名/発表者名: Obayashi E, Luna RE, Nagata T, Martin-Marcos P, Hiraishi H, Singh CR, Erzberger JP, Zhang F, Arthanari H, Morris J, Pellarin R, Moore C, Harmon I, Papadopoulos E, Yoshida H, Nasr ML, Unzai S, Thompson B, Aube E, Hustak S, Stengel F, Dagraca E, Ananbandam A, Gao P, Urano T, Hinnebusch AG, Wagner G, Asano K.
  • 雑誌名: Cell Report 巻: 18 ページ: 2651-2663
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2017.02.052
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structure, dynamics and interaction of p54nrb/NonO RRM1 with 5' Splice Site RNA sequence (2017)
  • 著者名/発表者名: Duvignaud JB, Bedard M, Nagata T, Muto Y, Yokoyama S, Gagne SM, Vincent M
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 55 ページ: 2553-2566
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.5b01240
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] Characterization of Glutathione-Dependent Enzymes from White Rot Fungi (2017)
  • 著者名/発表者名: Wan Hasnidah Wan Osman, Meng-I Lin, Keiko Kondo, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度京都大会
  • 発表場所: ウェスティン都ホテル京都（京都市）
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [学会発表] Heterologous expression of the ligninolytic enzymes from wood rotting fungi and analysis of peroxidase activity, lignin model degradation, and homologous modeling (2017)
  • 著者名/発表者名: Meng-I Lin, Keiko Kondo, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度京都大会
  • 発表場所: ウェスティン都ホテル京都（京都市）
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [学会発表] リグノセルロースの糖－リグニン複合体とその酵素反応の解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 西村 裕志,左近 静香, Jenny Arnling Baath, Amanda Ristinmaa, Johanna Nilsson, Gunnar Westman, Lisbeth Olsson, 永田 一真, 永田 崇, 片平 正人, 渡辺 隆司
  • 学会等名: 第67回日本木材学会大会
  • 発表場所: 九州大学（福岡市）
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-19
• [学会発表] 安定同位体標識法を用いたセルラーゼ糖質結合モジュールとリグニン間相互作用のNMRによる解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 徳永有希、大城理志、永田崇、近藤敬子、西村裕志、片平正人、渡辺隆司
  • 学会等名: 第67回日本木材学会大会
  • 発表場所: 九州大学（福岡市）
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-19
• [学会発表] Characterization of the deamination activity of APOBEC3B by real-time NMR, which is distinct from that of APOBEC3G (2017)
  • 著者名/発表者名: Li Wan, Takashi Nagata, Ryo Morishita, Akifumi Takaori-Kondo, Masato Katahira
  • 学会等名: 7th Asia-Pacific NMR Symposium
  • 発表場所: Indian Institute of Science (Bangalore)
  • 年月日: 2017-02-16 – 2017-02-19
  • 国際学会
• [学会発表] Sliding and intersegmental transfer along DNA enhance the enzymatic activity of APOBEC3G as revealed by real-time NMR monitoring methods (2017)
  • 著者名/発表者名: Keisuke Kamba, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • 学会等名: 7th Asia-Pacific NMR Symposium
  • 発表場所: Indian Institute of Science (Bangalore)
  • 年月日: 2017-02-16 – 2017-02-19
  • 国際学会
• [学会発表] Development of K+-responsive RNA aptamer and ribozyme, and in-cell NMR of nucleic acids in human cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Y. Yamaoki, A. Kiyoishi, T. Mashima, F. Kano, M. Murata, T. Nagata, M. Katahira
  • 学会等名: International Symposium for NMR of Nucleic Acids
  • 発表場所: Gyeongsang National Univ. (Korea)
  • 年月日: 2017-01-17 – 2017-01-17
  • 国際学会
• [学会発表] NMR study for the recognition of non-coding RNA and DNA by TLS/FUS, a key regulator of the transcriptional repression by cyclin D1 and telomere (2017)
  • 著者名/発表者名: K. Kondo, T. Mashima, T. Oyoshi, R. Yoneda, R. Kurokawa, T. Nagata, M. Katahira
  • 学会等名: International Symposium for NMR of Nucleic Acids
  • 発表場所: Gyeongsang National Univ. (Korea)
  • 年月日: 2017-01-17 – 2017-01-17
  • 国際学会
• [学会発表] リアルタイムNMRモニタリング法による酵素反応の定量解析及びヒト抗ウイルス因子ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの脱アミノ化機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 神庭圭佑、永田崇、片平正人
  • 学会等名: 定量生物学の会年会
  • 発表場所: 岡崎コンファレンスセンター（岡崎）
  • 年月日: 2017-01-08 – 2017-01-09
• [学会発表] 非コードRNAと結合してcyclin D1転写を抑制するTLS/FUSのRNA認識機構の構造学的基盤 (2016)
  • 著者名/発表者名: 真嶋司, 小澤 駿介, 近藤 敬子, Nesreen Hamad, 米田竜馬, 黒川 理樹, 永田崇, 片平 正人
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] プリオンタンパク質とプリオンタンパク質を標的とするRNA分子のAβ線維化への影響 (2016)
  • 著者名/発表者名: 飯田 真美子, 真嶋 司, 山置 佑大, 永田 崇, 片平正人
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] スライディングとストランド間移動を用いたヒト抗ウイルス因子APOBEC3Gの高効率なDNA配列探索：実時間NMRによる新知見 (2016)
  • 著者名/発表者名: 神庭 圭佑、永田 崇、片平 正人
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（つくば市
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] Characterization of the deamination activity of APOBEC3B by real-time NMR, which is distinct from that of APOBEC3G (2016)
  • 著者名/発表者名: Li Wan, Takashi Nagata, Ryo Morishita, Akifumi Takaori-Kondo, Masato Katahira
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（つくば市
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] 深層学習に支援されたNMRシグナルの自動解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小林直宏、服部良一、永田崇、児嶋長次郎、藤原敏道
  • 学会等名: 第55回NMR討論会
  • 発表場所: 広島国際会議（広島市）
  • 年月日: 2016-11-16 – 2016-11-18
• [学会発表] Cyclin D1遺伝子転写制御やテロメア長制御に関わるTLS/FUSタンパク質と非コード核酸間の相互作用のNMR法による解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 近藤 敬子, 真嶋 司, 大吉 崇文, 米田 竜馬, 黒川 理樹, 永田 崇, 片平 正人
  • 学会等名: 第55回NMR討論会
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島市）
  • 年月日: 2016-11-16 – 2016-11-18
• [学会発表] 木質バイオマスにおける超分子構造とステレオ選択的な酵素反応及び核酸のin-cell NMR (2016)
  • 著者名/発表者名: 山置佑大，永田一真、清石彩華、西村裕志、加納ふみ、村田昌之、大田ゆかり、渡辺隆司、永田崇、片平正人
  • 学会等名: 第55回NMR討論会
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島市
  • 年月日: 2016-11-16 – 2016-11-18
• [学会発表] Heterologous expression and structure-activity relationship analysis of the oxidative enzymes from wood rotting fungi that are involved in lignocellulose degradation (2016)
  • 著者名/発表者名: Meng-I Lin, Keiko Kondo, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • 学会等名: 第61回リグニン討論会
  • 発表場所: 京都大学（宇治市）
  • 年月日: 2016-10-27 – 2016-10-28
• [学会発表] リグノセルロースバイオリファイナリーのためのリグニン・ペプチド間相互作用解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 山口亜佐子、末富高志、大城理志、徳永有希、西村裕志、永田崇、真嶋司、 片平正人、磯﨑勝弘、高谷光、中村正治、渡辺隆司
  • 学会等名: 第61回リグニン討論会
  • 発表場所: 京都大学（宇治市）
  • 年月日: 2016-10-27 – 2016-10-28
• [学会発表] 海洋性細菌に由来するリグニンβ-O-4還元開裂酵素GST4の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 嶋根康弘、前田亜鈴悠、塩谷美夏、黒澤佳奈子、市川淳子、 布浦拓郎、山置佑大、永田崇、片平正人、高谷光、 吉田亮太、中村正治、渡辺隆司、大田ゆかり
  • 学会等名: 第61回リグニン討論会
  • 発表場所: 京都大学（宇治市）
  • 年月日: 2016-10-27 – 2016-10-28
• [学会発表] Investigation of the interactions between eukaryotic initiation factors implicated during ribosomal scanning and start codon recognition (2016)
  • 著者名/発表者名: Takashi Nagata
  • 学会等名: The 42nd Naito Conference on “In the Vanguard of Structural Biology: Revolutionizing Life Sciences
  • 発表場所: シャトレーゼガトーキングダム（札幌市）
  • 年月日: 2016-10-04 – 2016-10-07
  • 国際学会
• [学会発表] Non-coding RNA/DNA recognition by TLS/FUS that causes repression of cyclin D1 transcription and telomere elongation (2016)
  • 著者名/発表者名: Kondo, K., Mashima, T., Oyoshi, T., Yoneda, R., Kurokawa, R., Nagata, T. and Katahira, M.
  • 学会等名: The 43rd International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 発表場所: 熊本大学（熊本市）
  • 年月日: 2016-09-27 – 2016-09-29
  • 国際学会
• [学会発表] Invention of K+-responsive Tat-binding RNA aptamer and hammerhead ribozyme, and in-cell NMR of nucleic acids (2016)
  • 著者名/発表者名: Yudai Yamaoki, Ayaka Kiyoishi, Tsukasa Mashima, Fumi Kano, Masayuki Murata, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • 学会等名: The 43rd International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 発表場所: 熊本大学（熊本市）
  • 年月日: 2016-09-27 – 2016-09-27
  • 国際学会
• [学会発表] カリウムイオン応答性Tat結合RNAアプタマーおよびハンマーヘッドリボザイムの創製およびin-cell NMR法による細胞内核酸の観測 (2016)
  • 著者名/発表者名: 山置 佑大, 清石 彩華, 真嶋 司, 加納 ふみ, 村田 昌之, 永田 崇, 片平 正人
  • 学会等名: 第10回バイオ関連化学シンポジウム、第31回生体機能関連化学シンポジウム、第19回バイオテクノロジー部会シンポジウム
  • 発表場所: 石川県立音楽堂（金沢市）
  • 年月日: 2016-09-07 – 2016-09-09
• [学会発表] Development of artificial RNA and artificial peptide to control gene expression by using NMR (2016)
  • 著者名/発表者名: Yumi Takeda, Takashi Nagata, Ryo Amano, Yusuke Nomura, Kazuo Harada, Colin A. Smith, Masato Katahira, Taiichi Sakamoto
  • 学会等名: The 7th International Symposium of Advanced Energy Science
  • 発表場所: 京都大学（宇治市）
  • 年月日: 2016-09-05 – 2016-09-07
  • 国際学会
• [学会発表] Low-cost degradation of azo dyes using the GRP-tagged azoreductase combined with NADPH regeneration enzymes immobilized on the curdlan sheet (2016)
  • 著者名/発表者名: Masataka Horiuchi, Yasuhiko Suzuki, Masanori Ochiai, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • 学会等名: The 7th International Symposium of Advanced Energy Science
  • 発表場所: 京都大学（宇治市）
  • 年月日: 2016-09-05 – 2016-09-07
  • 国際学会
• [学会発表] Structural study of RNA aptamer and peptide that potently perturb the function of intrinsically disordered proteins related to disease (2016)
  • 著者名/発表者名: Takashi Nagata
  • 学会等名: The 5th International Symposium on Drug Discovery and Design by NMR
  • 発表場所: 理化学研究所横浜キャンパス（横浜市）
  • 年月日: 2016-08-29 – 2016-08-30
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Accurate and molecular-size-tolerant NMR quantitation of diverse compounds, and real-time monitoring of enzymatic reaction (2016)
  • 著者名/発表者名: Okamura, H., Kamba, K., Nishimura, H., Kigawa, T., Watanabe, T., Nagata, T., Katahira, M.
  • 学会等名: The XXVIIth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都市）
  • 年月日: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • 国際学会
• [学会発表] K+-responsive Activation of Ribozyme System via Structural Transition from Duplex to Dual-quadruplex Requiring no Heating and Cooling Treatment (2016)
  • 著者名/発表者名: Yudai Yamaoki, Takashi Nagata, Tsukasa Mashima, Masato Katahira
  • 学会等名: The XXVIIth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都市）
  • 年月日: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • 国際学会
• [学会発表] NMR analysis of the recognition of non-coding RNA and DNA by TLS/FUS which causes transcriptional repression of cyclin D1 and telomere shortening (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsukasa Mashima, Keiko Kondo, Takanori Oyoshi, Ryoma Yoneda, Riki Kurokawa, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • 学会等名: The RNA Society of Japan 18th Annual Meeting AND The 21st Annual Meeting of the RNA Society
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都市）
  • 年月日: 2016-06-28 – 2016-07-02
  • 国際学会
• [学会発表] Binding properties of high-affinity RNA aptamers against AML1 Runt domain (2016)
  • 著者名/発表者名: Ryo Amano, Kenta Takada, Yoichiro Tanaka, Takashi Nagata, Masato Katahira, Yoshikazu Nakamura, Tomoko Kozu, Taiichi Sakamoto
  • 学会等名: The RNA Society of Japan 18th Annual Meeting AND The 21st Annual Meeting of the RNA Society
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都市）
  • 年月日: 2016-06-28 – 2016-07-02
  • 国際学会
• [学会発表] K+-responsive activation of dual-quadruplex forming ribozyme system requiring no heating and cooling treatment (2016)
  • 著者名/発表者名: Yudai Yamaoki, Tsukasa Mashima, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • 学会等名: The RNA Society of Japan 18th Annual Meeting AND The 21st Annual Meeting of the RNA Society
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都市）
  • 年月日: 2016-06-28 – 2016-07-02
  • 国際学会
• [学会発表] Analysis of molecular interaction of peptides with lignin for lignocellulosic biorefinery (2016)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, T., Yamaguchi, A., Oshiro, S., Suetomi, T., Nishimura, H., Nagata, T., Mashima, T., Katahira, M., Isozaki, K., Takaya, H. and Nakamura, M.
  • 学会等名: 4th Symposium on Biotechnology applied to Lignocelluloses
  • 発表場所: CSIC downtown Campus (Madrid)
  • 年月日: 2016-06-19 – 2016-06-22
  • 国際学会
• [学会発表] プリオン蛋白質とそれを標的とする RNA 分子の A β線維化への影響 (2016)
  • 著者名/発表者名: 飯田 真美子, 真嶋 司, 山置 佑大, 永田 崇, 片平正人
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [学会発表] Cyclin D1転写抑制を担う TLS/FUS タンパク質と非コード RNA の相互作用の NMR 法による解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 真嶋司, 小澤 駿介, 近藤 敬子, 永田崇, 黒川 理樹, 片平 正人
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09