| 研究課題/領域番号 |
26440039
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
鎌田 勝彦 独立行政法人理化学研究所, 平野染色体ダイナミクス研究室, 専任研究員 (70360526)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 蛋白質複合体 |
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| 研究実績の概要 |
植物ゲノムのエピジェネティックな遺伝子発現抑制機構として、転写装置と共役した遺伝子サイレンシングが報告されている。その中でも、RNA-directed DNA methylation (RdDM)は、DNAのde novoメチル化による発現抑制機構の一つであり、遺伝学的解析の結果から、この機構に関与する様々な蛋白質因子が同定されている。その中の幾つかは、真核生物の染色体凝縮に関わるSMC蛋白質に類似した構造的特徴を有しており、遺伝子不活性化機構と染色体形成機構の関連性が注目されている。
DDR複合体は、植物特異的なRNAポリメラーゼVの転写に同行し、RdDMのメチル化反応を受けるDNA基盤を確保すると考えられ、DMS1 (DRD1), DMS3, DMS7(RDM1), DMS11の遺伝子産物で構成される。文献によると、これらの3または4つの遺伝子産物が、in vitroにおいて相互作用が確認されているが、その結果は十分な整合性がとれていない。平成26年度は、これら遺伝子のクローニングと各蛋白質の相互作用を再評価するため、基礎実験を中心に進めた。シロイヌナズナのcDNAライブラリーから各遺伝子のクローニングをから行い、それらの産物を大腸菌で発現させると、蛋白質のDMS7は可溶画分に見られたが、その他の蛋白質は不溶性であった。SMC蛋白質様のドメイン配置を有するDMS3はN末端領域の欠失によって可溶性を示した。このDMS3は全長のDMS７と安定な複合体を形成し、ゲル濾過によってその量論比を確認することが出来た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
データベース上の配列の間違いに翻弄された、そのクローニングのトラブルがあったが、おおむね順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、酵母two-hybridで遺伝的相互作用を確認しながら進める。さらに、昆虫細胞・バキュロウイルス発現系を用いて複数の遺伝子を同時に発現させ、蛋白質間相互作用の安定性を指標に複合体の精製を行い、構造的にコアとなるサブユニットの割出しを行う。さらにその精製複合体を、MALDI-TOF質量分析や各種プロテアーゼによる限定分解のステップを駆使し、各蛋白質の構造的に安定なドメインで構成される最小構造領域を決定し、逐次的に機能領域の単離同定を行い、可能なものから結晶化を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進行度から判断して、次年度に使用するのが得策と判断したため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の結晶化条件のスクリーニングなどの消耗品に使用する予定である。
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