| 研究課題/領域番号 |
26440039
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
鎌田 勝彦 国立研究開発法人理化学研究所, 平野染色体ダイナミクス研究室, 専任研究員 (70360526)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 染色体凝縮 / エピジェネティック / 蛋白質複合体 / Ｘ線結晶構造解析 / 構造生物学 |
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| 研究実績の概要 |
植物ゲノムのエピジェネティックな遺伝子発現抑制機構として、転写装置と共役した遺伝子サイレンシングが報告されている。その中でも、RNA-directed DNA methylation (RdDM)は、DNAのde novoメチル化による発現抑制機構の一つであり、遺伝学的解析の結果から、この機構に関与する様々な蛋白質因子が同定されている。その中の幾つかは、染色体凝縮に関わる蛋白質に類似した構造的特徴を有しており、遺伝子不活性化機構と染色体形成機構の関連性が注目されている。
シロイヌナズナ由来のDMS3蛋白質は、大腸菌での発現と可溶性が不安定であったが、大腸菌にコドン調製された遺伝子を用いて発現、またDMS7と共発現させることによって、精製効率が大幅に改善された。これによって、精製したDMS3-7複合体を、各種プロテアーゼによる限定分解後にMALDI-TOF質量分析やアミノ酸配列解析によって分析することができ、DMS3のコアドメインを単離することができた。その後、DMS3のコイルドコイル領域の状態を推測し、長さの異なるコンストラクトを作製した。これらの組換え蛋白質を用いてDMS7との結合状態を確認したところ、DMS7はDMS3のコアドメインと結合するが、ある一定の長さのコイルドコイル領域をもつDMS3組換え蛋白質とは結合しなくなることがわかった。この結果から、DMS3へのDMS7の結合は、DMS3のコイルドコイル領域のコンフォメーションまたは配向に依存していると推察することができた。SMC蛋白質複合体に含まれるヒンジドメインにも同様のコンフォメーション変化があることが期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度までに実験を終了する予定であったが、論文掲載に思ったより時間を費やしたため、出版費等を残して延長せざるを得なかった。それでも、先に構造解析が終わったSMC蛋白質のドメインの構造解析の結果をいくつかの遺伝学的知見と併せ、無事に年度末に出版することができた。これによって、SMC蛋白質のドメインの新たな知見を生み出すことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
残りの研究期間で、現在の研究を一定の形にまとめること、また次の実験につながる予備実験を行うことを目標としている。特にDDR複合体のすべてのサブユニットの遺伝子をコドン最適指された合成遺伝子を交換して、バキュロウイルスと昆虫細胞使った発現系の構築を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末の論文出版となったため、2017年度の研究経費を残さざるを得なかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
この報告書を書いている現在、そのほとんどを既に出版費に使ってしまった。
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