| 研究課題/領域番号 |
26440057
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
矢尾板 芳郎 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (00166472)
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| 研究分担者 |
田澤 一朗 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (10304388)
中島 圭介 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (60260311)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ネッタイツメガエル / TALEN / 変態 / ゲノム編集 / 甲状腺ホルモン受容体 / 細胞外基質分解酵素 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、一連の変態関連遺伝子を標的としたTALENによる標的遺伝子破壊を行ったネッタイツメガエルの表現型の解析により変態関連遺伝子の機能を明らかにして、相応する遺伝子のノックアウトマウスで報告されている表現型と比較することにより、両生類の変態が哺乳類のどの時期に対応するかを検討することである。
変態関連遺伝子として、甲状腺ホルモン受容体α (TRα)、甲状腺ホルモン受容体β (TRβ)、甲状腺ホルモン活性化酵素 (D2)、甲状腺ホルモン不活性化酵素 (D3)、細胞外基質分解酵素であるstromelysin3 (STL3)とMMP9TH、細胞死関連酵素であるcasp3とcasp9、T細胞の分化に必要な遺伝子であるFoxn1とDNA-PK、尾の退縮時に幼生抗原として働くと考えられているouro1とouro2を選んだ。これらの遺伝子を標的とするTALENを設計し、Cermak法により組み立てて、TALENをコードするmRNAを合成し、ネッタイツメガエルの受精卵に注入した。
その結果、TRαとcasp9以外を標的とするTALENは96-100％の変異導入率を示した。TRαとcasp9に対するTALENは各々、50％と14％であった。casp3に対するTALEN mRNAを導入した胚は弱く、発生途中で全て死んでしまったが、それ以外の遺伝子を標的とするTALEN mRNAを注入した胚は正常な発生を継続する事ができた。
私たちは、計画通りに進まない時の対応として、特に、変異により致死になり易い遺伝子のため、生殖細胞に特異的に発現するTALENシステムを開発した。これにより体細胞の標的遺伝子の変異の頻度を低く抑える事が可能になるため、TALEN mRNAを注入したF0の生存率や成熟率は高くなる。この生殖細胞に特異的に変異を誘導するTALENシステムをcasp3に対して用いた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２６年度の計画では、１）TALENの設計、２）TALEN遺伝子の組み立てとTALEN mRNAの合成、３）TALEN mRNAのネッタイツメガエル受精卵への注入、４）TALENの活性の評価となっている。計画した変態関連遺伝子１２個の全てに対してTALENの設計からネッタイツメガエル受精卵への注入まで実施した。TALENの骨格構造としては、N末C末欠損型のTALENでheterodimeric FokI触媒ドメインベクター(ΔNΔC-ELD/KKR)を使用し、胚への毒性を低くするように配慮した。TALEN mRNAを受精卵に注入して２日後のF0胚から抽出したゲノムDNA を用いたTALEN活性の評価では、TRαとcas9以外を標的とするTALENでは変異導入率が96-100%であった。TRαとcas9のTALENの変異導入率は各々、50%と14%であった。cas9もcas3も細胞死の経路の重要な遺伝子であるが、マウスではcas9のノックアウトもcas3のノックアウトも同様な表現型を示すのでcas9のノックアウトを作製する事を止めることにした。DNA-PKを標的にするTALENは100%の変異導入率を示したが、全てin-frameの変異であった。DNA-PKのout-of-frameの変異が検出できないことは、その変異が胚の各細胞にとって致死である事を示唆していると考え、また、DNA-PKがDNA修復酵素として重要な働きを持っている事を考慮して、DNA-PKのノックアウトを作製する事を諦めることにした。cas3を標的とするTALENは100%の変異導入率を示したが、生存率が低いため、生殖細胞に特異的に変異を誘導するTALENシステムをcasp3に対して使った。それ以外でも、ホモの変異が致死性である可能性が高い遺伝子に関しては、生殖細胞特異的に変異誘導するシステムを採用した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の予定では１）TALEN mRNAを注入したカエルの交配、２）標的遺伝子変異のホモの個体のスクリーニング、３）ノックアウトガエルの解析と実験を続けることになっている。
ネッタイツメガエルの交配では、特にメスが１０―１２ヶ月齢ぐらいになってから、安定して受精卵が得られるようになる。得られた各幼生から尾の一部を切り取り、ゲノムDNAを抽出して、標的配列を含む領域をPCRで増幅し、塩基配列を決定する。F1個体から２種類のframe shiftが見つかれば、全ての遺伝子が不活性化されたと考え、飼育を続ける。１種類のout-of-frameだけが見つかれば、他方の遺伝子に大きな欠失が起きていると考えて、標的遺伝子を含む広い範囲で遺伝子断片を増幅する必要がある。当然、野生型やin-frameの遺伝子が一個でも見つかれば、その個体はnegative controlとして扱う。
変態時には、四肢の発達、尾やエラの退縮、神経系の再構築、小腸の短縮と肉食用腸管への変化、陸上生活のための皮膚の作り替え、膵臓や肝臓の作り替え、幼生型から成体型赤血球への交換、拒否反応の開始等が起き、全身の体の作り替えが見られる。それらの点を考慮して、ノックアウト個体と確定すれば、生存率や手足の成長を追跡し、頭部の変形や尾の退縮等の経時変化に注目して観察する。また、時には固定して腸の形態等の内蔵組織の変化にも注意を払い、一方、臓器からRNAを抽出して各遺伝子発現も測定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品等がかかりすぎて、購入予定の機械を購入するにはお金が足りなくなったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度に機械の購入を含めて、使用予定。
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