| 研究課題/領域番号 |
26440069
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
山地 俊之 国立感染症研究所, その他部局等, 主任研究官 (50332309)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | スフィンゴ糖脂質 / 志賀毒素 / ゲノムワイドスクリーニング / shRNA / 遺伝子編集法 |
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| 研究実績の概要 |
スフィンゴ糖脂質は、その機能として高次機能や疾患に深く関与することが知られている。志賀毒素（ベロ毒素）は腸管出血性大腸菌の病原性因子であり、細胞表面の糖脂質Gb3に結合後、エンドソーム-ゴルジ体-小胞体-細胞質内へと逆輸送され、リボソームを不活化することで細胞死をもたらす。この毒素を用いて遺伝学的スクリーニングを行うことで、(a) 志賀毒素-Gb3複合体の逆輸送に関する因子、(b) 受容体Gb3の生合成に影響する因子 (生合成酵素に影響する因子やスフィンゴ脂質輸送に関する因子) の同定が期待できる。本研究目的は、プール型レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた、遺伝子発現低下による志賀毒素耐性スクリーニングを行うことによって、スフィンゴ糖脂質代謝・輸送に影響を及ぼす新規因子の網羅的な同定・解析を行うことである。
H26年度は次世代シークエンサーを用いた網羅的解析により、志賀毒素に耐性を示す複数のshRNA候補群を同定した。この中にはGb3の生合成に関するGlcCer合成酵素(UGCG)、LacCer合成酵素(B4GalT5)、UDP-ガラクトース-4-エピメラーゼ(GALE)、また志賀毒素の逆輸送に関するVPS53等の遺伝子などが含まれていた。一方候補群の中には、オフターゲット効果による偽陽性も見られた。例えば一見耐性を示しそうなセラミド合成酵素の一種CERS2も偽陽性であり、遺伝子編集法で新たに作製したCERS2のノックアウト細胞では、志賀毒素に耐性を示さなかった。現在得られた候補群の中から、実際どの遺伝子が志賀毒素による細胞死に影響を及ぼすかについて検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H26年度は、一次スクリーニングで得られた志賀毒素耐性shRNA候補のうち約70種類について、個々のshRNA発現細胞株を作製し、志賀毒素に対する影響を検討した。その結果多くのshRNAが程度の差はあるものの耐性を示した。このことは、レンチウイルスshRNAライブラリーと次世代シークエンサーを用いた今回のスクリーニングが機能していることを示している。ただし本研究においてもshRNA(RNAi)の大きな問題点であるオフターゲット効果による志賀毒素耐性が見られた。例えば、候補群の中にはスクリーニングに使用したHeLa細胞に発現していない遺伝子に対するshRNAが含まれていた。さらにいくつかの遺伝子に対しては、志賀毒素に耐性を示すshRNA発現株にcDNAを発現させることで、表現系が親株と同様となるかレスキュー実験を行ったが、志賀毒素感受性はもとに戻らず、オフターゲットであることが判明した。一方GALE遺伝子に関しては、確かにこの遺伝子の発現抑制によりGb3の低下が見られ、その結果志賀毒素に耐性を示すことを確認した。今後はオフターゲットをどのように除外していくかが課題である。
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| 今後の研究の推進方策 |
H27年度はH26年度に同定したshRNA候補群のうち、特に複数箇所に対するshRNAが含まれていた遺伝子に関して、その発現低下が志賀毒素に耐性をもたらすか、以下の方法を用いて確認する。
(a) mRNA低下の確認-上記のshRNA安定発現株において、実際mRNAの低下が見られるかRealtime PCRで確認する。(b) cDNA過剰発現による回復実験-解析する遺伝子のcDNAをクローニングする。shRNA発現細胞にそれぞれ対応するcDNA (もしくはRNAi抵抗性cDNA)を発現させ、志賀毒素に対して感受性が戻るか検討する。(c) 遺伝子編集法によるノックアウト細胞の作製-上記の結果が微妙な判定の場合、遺伝子編集法を用いて遺伝子ノックアウト細胞を樹立し、志賀毒素に耐性を示すか確認する。
陽性であった場合は、以下の方法により志賀毒素に耐性を示す作用点を検討する。
(a) FACS解析-上記のshRNA発現HeLa細胞もしくはノックアウト細胞を用いて、Gb3の細胞表面発現量を蛍光ラベルしたStx1Bサブユニットで染色し、FACS解析を行う。染色量が低下していれば、志賀毒素耐性の原因がGb3の生合成もしくはその後の輸送・膜ドメイン形成の異常であり、維持されていれば、志賀毒素の小胞体・サイトゾルへの逆輸送に異常であると目星を付ける。(b) スフィンゴ脂質解析-FACS解析で染色低下が見られたものに対し、 [14C]ガラクトース、[14C]セリン、あるいは[3H]スフィンゴシンによるパルスラベルを行うことで、生合成のどのステップに異常があるか検討する。これらにより志賀毒素耐性の原因が (1) 糖脂質の生合成 (どの点の異常かも含め) (2) 細胞表面発現輸送 (3) 細胞表面からの逆輸送、のいずれに当たるか見当をつける。(c) 同定されたタンパクの機能解析-抗体染色 (なければペプチド抗体の作製も考慮) もしくはGFP融合タンパクを用いて同定されたタンパクの細胞内局在を共焦点顕微鏡で観察し、そのタンパクが機能している部位を推測する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
大量に購入したプライマーの価格が当初想定した価格より安価であったこと、及び放射性研究用試薬等以前の残りを使用することで当所計画より経費の節約が出来たため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
H27年度は、通常の分子生物学的試薬、細胞培養試薬の他、遺伝子ノックダウン株の脂質分析にスフィンゴシン等高価な放射性物質の購入が必要となるため生化学用試薬、更に単離されたタンパクに対する抗体を用意するための免疫化学用試薬の購入を計画している。また学会参加に関しては年に国内1回と海外１回の予定である。
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