| 研究課題/領域番号 |
26440084
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
古池 晶 大阪医科大学, 医学部, 助教 (60392875)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ATP合成酵素 / 分子モーター / １分子観察 |
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| 研究実績の概要 |
ATP合成酵素(VoV1)は、2種の回転分子モーターから成り立つ膜蛋白質である。一つは水溶性部分のV1で、ATP触媒機能を持つ。もう一つは膜内在部分のVoで、膜を介したプロトン輸送を担う。共通の回転棒で連結されているので、それぞれのモーターは相手と連動して回転する。構造や機能は、発電機（マクロなスケールでの機械）に似ているが、ナノスケールの世界では慣性力が働かないので、発電機のように惰性で回転することはない。回転を持続するには、一方のモーターからの駆動力が絶えず相手側に伝達される必要がある。そのとき、各モーター内で起きる化学イベント（V1でのATP加水分解の各素過程とVoでのプロトン輸送の各素過程)は厳密に対応しているはずである。本研究では、その化学イベントの対応付けを最終目的に掲げ、まずモーター間の駆動力の伝達に分子内弾性が寄与しているか否かを、先行実験をもとに、1分子観察で明らかにする。
本年度は、駆動力伝達に分子内弾性が寄与している可能性として、VoV1分子全体がツイスト運動をしているか否かを、従来からの方法で調べた。界面活性剤で可溶化したVoV1にひとつの目印を付け、その軌跡を1分子観察したが、先行実験と同じように真円の軌跡は得られなかった。また、より生理条件に近い状態での観察を目指し、VoV1を膜骨格タンパク質（MSP）によるによる直径～10 nmの脂質膜（ナノディスク）へ再構成することを試みた。再構成されている結果は得られたが、1分子観察では発見確率が低く、回転速度もATP加水分解速度から予想されるものより桁違いに遅かった。ナノディスクを構成する脂質の組成の見直す必要がありそうである。
観察されたVoV1の楕円運動は、ツイスト運動の必要条件でしかないので、今後目印を付ける場所を変えて確認していきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は当初の研究計画どおり、従来からの方法を用いて、VoV1のツイスト運動を確かめた。必要条件としての楕円運動は確認されている。VoV1をナノディスクへ再構成することはできた。1分子観察では明快な回転運動は得られていないが、研究計画でも試行錯誤を必要とする課題として挙げていた。観察系の改良として、レーザー光源を高輝度LEDに変更する予定であったが、むしろ感度の良いカメラに変更したほうが汎用性が高いと判断し高感度ハイスピードカメラを導入した。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の年次計画通り、24年度は引き続き
A-1) 従来からの方法を用いて－1個の目印を用いたVoV1のツイスト運動の実証を行うとともに、
A-2) 目印やその付ける場所を変えて－1個の目印を用いたVoV1のツイスト運動の実証を始める。
また、本年度で得られなかった、1分子観察可能なナノディスクに再構成したVoV1の作製も引き続き試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、ほぼ計画通りに進んだため、約50千円（年度研究費の約1.5％）のみが次年度使用額として生じた。蛋白質精製用の試薬購入予定であったが、わずかに足りなかったため、次年度に購入することにした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は、先のように蛋白質精製用の試薬購入に充てる。
次年度分の研究費は、当初の計画どおり、消耗品および旅費として使用する。
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