| 研究課題/領域番号 |
26440115
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
道上 達男 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (10282724)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 細胞張力 / 細胞形状 / 細胞骨格 / 神経領域規定 |
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| 研究実績の概要 |
(1)張力実測のための新規FRETプローブの培養細胞における評価
本年度は、FRETプローブを用いた張力実測系の基本的な検証を行った。張力プローブはN末端・C末端を分割したアクチニンと二種の蛍光タンパク質、更には両者を連結するリンカータンパク質からなるコンストラクトである。本張力プローブに関しては、培養細胞でのプローブバリデーションがきちんとできていなかったため、本年度はまず培養細胞をもちいたバリデーションを行うこととした。コンストラクトは、二種類のリンカータンパク質を連結したもの(construct#1, #2)を用いた。また、ネガティブコントロールとして、全長のアクチニンを蛍光タンパク質の外側に配置したコンストラクト(#1N, #2N)を準備した。これら合計4種類のコンストラクトをHEK293細胞に導入し、FRET光の観察を行った。その結果、(1)#1, #2ともにFRET光が観察された(2)特に#2系列ではFRET光が#2<#2Nとなり、予想通りの結果が得られた。以上の結果より、プローブが期待通り機能することを確認することができた。
(2)外胚葉における細胞運動と神経境界規定との関連
原腸胚～神経胚期におけるアクチンの配向性の違いが実測できるかどうか、ファロイジン染色を行ったが、現在のところは神経―表皮領域間で局在の大きな変化が見いだせていない。そこで、アクチン結合タンパク質moesinにGFPを連結した融合タンパク質を胚に発現し、原腸胚期から神経胚期にかけタイムラプス画像を取得して局在の違いを観察したところ、神経外胚葉において、細胞内のmoesinの局在が細胞進行方向の逆側で減少していた。これは、張力が強く働く細胞進行方向で必要とされるmoesinの細胞内供給に伴うものであることを示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
張力プローブによる張力実測については、培養細胞を用いたプローブバリデーションを行い、本プローブが張力実測に実際に適用することが可能であることを示せたのは大きな進展である。関連する成果としては、別課題による研究結果ではあるが、胚を用いた張力実測を行い、これも成功している。来年度からは本予算で本格的に研究を展開する前段階として、十分な進展が図れることが期待される結果となった。本課題については、FRETプローブを用いて胚全体の張力実測を行った既知の論文がないため、その点でも新規性が高く、本結果が非常に重要であることを間接的に示している。
一方で、アクチンなど細胞骨格の配向性などから神経―表皮領域の違いを見いだす試みについては、moesinの解析によりようやく解析の道筋がついたところであるが、特に直接細胞骨格やECMを観察することによる、神経―表皮領域の違いを見いだすには至っていない。推進方策にも記載するように、別の解析手法を検討する必要があると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２７年度は、胚における張力実測を本格的に行う。まずは正常胚の外胚葉領域についてFRETプローブを用いた張力実測を行い、神経領域と表皮領域の違いを見出したい。また、タイムラプス観察を行う事によって、各外胚葉領域における張力の時間的変化をより明確にする。その上で、細胞に様々な影響を与えた場合、例えば浸透圧を変化させる、アクチンなどの重合阻害剤添加、更にはアクチン重合の上流で機能するシグナル伝達経路に影響を与える薬剤の添加などにより、張力に変化が生じるかを観察する。
細胞骨格、ECMと神経領域ー表皮領域との関連については、moesinなどアクチン結合タンパク質の動態をより詳細に調べる。また、関連する新しい観点として、神経・表皮間での細胞群の固さ（stiffness）の違いについて解析を行いたい。予備実験としては、同じ圧力を外胚葉の一部分（細胞群、あるいは単一細胞）のみにかけた場合の凹み度合の違い、細胞骨格の配向・局在量の変化を調べる。また、同様の変化がアクチンの重合阻害剤添加などで生じるかどうかも併せ検討する。可能ならば、張力プローブのシグナル強度と細胞骨格の配向などの関係についても、CFP融合コンストラクトなどの作成を通して解析したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初設備費としてインジェクターの購入を予定していたが、別途貸与が可能となり購入の必要がなくなったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度において、消耗品費ととして使用する予定である。
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