Pitx2の下流の分子機構と左右非対称な形態変化の解析

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26440124
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 白鳥 秀卓 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (90362590)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 左右軸 / 細胞外マトリックス / Pitx2

研究実績の概要

マウス胚の左側特異的に発現し左右非対称な器官形成を支配する転写因子Pitx2のmRNAは、頭尾軸にそって左側側板中胚葉の全域で発現するが、左右非対称に発現する細胞外マトリックス因子LR1変異マウスでは、発現が減弱していた。この異常を確認するために、Pitx2-LacZトランスジーンの発現変化を調べた結果、LR1変異マウスにおける発現の減弱をより明確に確認できた。
LR1変異マウスが示す左右非対称な形態異常がLR1の左右非対称な発現が無くなったことによることを証明するために作製してきた２種類のマウス（1. LR1変異マウスに左側側板中胚葉特異的にLR1を発現するトランスジーンを導入したレスキュー実験用のマウス。2. 同定済みのLR1の左右非対称な発現に必要な塩基配列に点変異を導入したマウス）が樹立でき、解析を行った。その結果、後者のマウスがLR1変異マウスと同様の左右非対称な形態異常を示し、以下のことを明らかにできた。
1. 細胞外マトリックスやその構成因子であるLR1が左右非対称な形態形成に必要であること。
2. トランスジーンの実験結果から同定していたLR1の左右非対称な発現に必要な塩基配列が、生理的に必要であること。さらに、この塩基配列は左右非対称に発現するNodalにより活性化される転写因子の結合配列であることから、NodalによるLR1の発現制御が必要であることも明らかにした。
LR1変異マウスの解析はB6/129系統で行ってきたが、B6純系に近い系統で解析したところ表現型が重度になった。その結果、LR1の必要性を確実にできたとともに、B6系統を使うことで今後の解析が効率的になった。また、系統間の表現型の違いを利用して、左右非対称な形態形成に必要な新規遺伝子にもつなげることができた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

当研究課題は、心臓流出路の左右非対称な形成機構の解析、四肢の左右非対称性の解析、左右非対称な器官形成を制御する細胞外環境の解析の３項目からなる。
左右非対称な器官形成を制御する細胞外環境の解析は順調に大きく進展したが、四肢の左右非対称性の解析と心臓流出路の左右非対称な形成機構の解析をあまり進めることができなかったので、「(3)やや遅れている」と評価した。

今後の研究の推進方策

１．心臓流出路の左右非対称な形成機構の解析：心臓流出路の細胞形態、細胞移動、細胞増殖の特徴を明らかにして、PCP関連分子やFgfシグナルの役割を解析する。
２．四肢の左右非対称性の解析：四肢の神経走行や神経支配について、左右の違いや野性型と変異マウスの違いを検出する。CRISPR/CAS法を利用して、変異動物を作製する。
３．左右非対称な器官形成を制御する細胞外環境の解析：LR1の左右非対称な発現に必要な塩基配列に点変異を導入したマウスを利用したり、LR1変異マウスのB6系統への戻し交配をしながら、LR1発現領域の細胞形態や細胞移動を解析する。細胞外マトリックス因子LR1の欠損が、左右非対称に発現する分泌因子Nodalの拡散を制御している可能性を解析するために、Nodalの拡散を観察できる実験系を構築する。
平成28年4月から所属を変更したため、研究遂行に必須の実験動物も移動する必要がある。移動にあたり、一時的に各種変異マウスが減るため変異マウスの新規サンプルを得るのが難しくなるが、その間は、所属変更前に集めたサンプルや野性型で行う細胞形態や細胞移動の解析・観察系の構築を進める。

次年度使用額が生じた理由

研究代表者が平成28年3月で大阪大学を退職し、同4月から京都産業大学に異動した。異動の準備のため、一時的に研究の進行が遅れたため、助成金を次年度使用することになった。

次年度使用額の使用計画

異動後、一時的に研究の進行が遅れるが、共同研究者など研究の協力体制も整う予定であり、これまで以上に研究を推進できる計画を立てている。また、遅れている観察系の構築などにも助成金を使用していく予定である。

研究成果

• [国際共同研究] Institute of Medical Biology, A*STAR(シンガポール)
  • 国名: シンガポール
  • 外国機関名: Institute of Medical Biology, A*STAR
• [国際共同研究] Queen Mary University of London(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: Queen Mary University of London
• [雑誌論文] Single-Cell Expression Profiling Reveals a Dynamic State of Cardiac Precursor Cells in the Early Mouse Embryo (2015)
  • 著者名/発表者名: Ioannis Kokkinopoulos, Hidekazu Ishida, Rie Saba, Prashant Ruchaya, Claudia Cabrera, Monika Struebig, Michael Barnes, Anna Terry, Masahiro Kaneko, Yasunori Shintani, Steven Coppen, Hidetaka Shiratori, Torath Ameen, Charles Mein, Hiroshi Hamada, Ken Suzuki, Kenta Yashiro
  • 雑誌名: PLos One 巻: 10(10) ページ: e0140831
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0140831
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Wnt5a/5bとWntのインヒビターの非対称な分布がノードの細胞極性を決めている (2015)
  • 著者名/発表者名: 峰岸 かつら, 橋本 昌和, 安島 理恵子, 五十嵐 康伸, 篠原 恭介, 白鳥 秀卓, 濱田 博司
  • 学会等名: 第３８回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートピアホテル（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-12-04
  • 招待講演