| 研究課題/領域番号 |
26440130
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
小田 康子 (秋山康子) 大阪医科大学, 医学部, その他 (80426650)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ゲノム / RNA干渉 / RNA-seq / ヘッジホッグ / 初期発生 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、調節的な発生において位置情報と細胞の行動がどのように協調的に制御されるかを理解することを目指し、オオヒメグモの初期胚を実験系として、パターン形成や細胞移動、再配列運動の制御に関わるヘッジホッグに注目して解析している。昨年度までにparental RNA干渉(pRNAi)とRNAseqを組み合わせた実験法と、解読されたゲノム情報を利用した解析法を確立し、ヘッジホッグ遺伝子とヘッジホッグの受容体であり抑制因子をコードするパッチト遺伝子、コントロールとしてクラゲのgfp遺伝子に対するpRNAiを行い、pRNAi胚と正常胚で発現量に変化のある遺伝子をゲノムワイドに探索した。探索結果の比較から、90の遺伝子がヘッジホッグとパッチトのどちらのpRNAiでも発現量に変化があることを明らかにした。
今年度はまず、以前から開発に取り組んでいた蛍光in situハイブリダイゼーションの手法を論文にまとめて発表した。この手法は今後の発現解析に有用であり、他の研究者にも役立つものである。次に、昨年度同定した90遺伝子を全てクローニングし、プローブを作製し、in situハイブリダイゼーションによる発現パターンの解析を行った。その結果、約半数の遺伝子が正常胚において発生初期の胚盤で領域特異的な発現を示すことが分かった。続いて、これらの領域特異的な発現を示す遺伝子の発現解析をヘッジホッグ及びパッチトのpRNAi胚において行ったところ、ヘッジホッグ・シグナルの強度に応じた遺伝子発現の時空間制御があり、それにより将来の頭尾軸につながるパターンが形成されることを示唆するデータを得た。さらに、ヘッジホッグ・シグナルで制御される遺伝子が、続いて起こる発生のプロセスにどう関わるかを明らかにするために、１つの遺伝子に注目し、pRNAiとRNAseqによる解析を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヘッジホッグとパッチトのpRNAiでともに発現量に変化の見られた遺伝子のクローニングと発現パターン解析を終えることができ、さらに、そこから発現領域とヘッジホッグ・シグナルによる制御の関係性を見出すことができたのは大きな成果である。ヘッジホッグ・シグナルにより制御を受ける遺伝子の１つ、msh遺伝子に関してpRNAiとRNAseqによる解析を既に開始しており、本研究の成果を論文としてまとめるデータが揃いつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. msh pRNAi胚の表現型の解析。昨年度、msh遺伝子はヘッジホッグ・シグナルと密接に関係があると判断し、pRNAiとRNAseqによる解析を開始した。pRNAi胚に明らかな形態的異常が認められているので、その表現型に関して、胚盤のパターン形成から次への展開という点にしぼって解析を進める。
2. 発現量解析のまとめとGene ontology解析。初年度に発現量に変化があると同定した遺伝子に関して、発現パターンとヘッジホッグ・シグナルの強度に対する発現量変化の挙動をもとに遺伝子群をグループ分けする。次に、これまでヘッジホッグ・シグナルが機能することが知られている脊椎動物の神経管や肢芽のパターン形成と、ショウジョウバエの初期発生、細胞の移動や極性形成に関わる遺伝子ネットワークとの類似点等についても検討する。ここまでの結果を、論文としてまとめる。
3. 候補遺伝子の機能解析。初年度に同定したmsh以外の候補遺伝子に関しても機能解析を開始する。pRNAi胚の表現型の解析、発現領域の解析、関与する現象の細胞レベルでの解析を行う。ヘッジホッグ・シグナルにどのように制御されているかに加えて、ヘッジホッグ・シグナルの制御に関わっているか、さらには、候補遺伝子同士の関係性も明らかにする。これらの解析を通して、初期胚を構成する細胞の動態を協調的に制御する分子機構の理解を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は実験を集中的に行ったために学会参加が予定より少なくなったため。また、論文の投稿に科研費を使用しなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
胚発生での表現型を解析するための分子生物学用及び組織化学用実験の試薬と消耗品の購入と、次の論文の投稿費用に使用する。
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