研究課題
GA信号伝達においてDELLAタンパク質は、抑制因子として知られている。DELLAタンパク質は、機能未知の核タンパク質であり下流の信号伝達を抑制している。GA投与によりDELLAタンパク質が速やかに分解され抑制が解除されることでGA応答が誘引される。DELLAタンパク質の相互作用因子GAF1の単離に成功しDELLAタンパク質が、GAF1と相互作用することによって、下流の標的遺伝子の制御を行っていることを明らかにしてきた。GAF1は、さらにコリプレッサーであるTOPLESS様タンパク質TPRと相互作用することが明らかとなった。DELLAタンパク質はコアクチベーターとして、TPRはコリプレッサーとして機能する。GAは、DELLAの分解を介して、GAF1複合体をアクチベーターからリプレッサーに変換することで、標的遺伝子の発現を調節している。本年度は、GAF1が植物体内でリン酸化修飾されている可能性を示し、リン酸化修飾によるGAF1複合体の機能調節について解析を行なった。
2: おおむね順調に進展している
植物体内における、GAF1の翻訳後修飾の有無を検討するため、mycタグを付加したGAF1タンパク質発現する、形質転換植物を作製した。myc抗体を用いたウェスタンブロット解析などより、特定のバンドシフトが検出されることからGAF1タンパク質が植物体内でリン酸化修飾を受けている可能性が示された。GAF1内のリン酸化部位を同定するために、リン酸化予想部位に変異を導入した変異型GAF1を作製しトランジェントアッセイを用いて解析を行なった。リン酸化を受けないGAF1変異タンパク質、リン酸化を模したGAF1変異タンパク質を用いたトランジェント解析では野生型のGAF1に対して異なる転写活性能を示した。これらの解析により、GAF1のリン酸化修飾の候補となる領域を同定した。今後、変異型GAF1を発現する形質転換体を作製し、GAF1のリン酸化修飾部位の同定や、生理学的意義を検証する。
形質転換体を作製し、GAF1のリン酸化修飾部位を同定する。また、リン酸化によりGAF1の転写活性化能が変化するが、GAF1複合体はコアクチベーターであるDELLAタンパク質、コリプレッサーであるTPRと相互作用し、その機能がGAにより変換されることを明らかにしてきたが、リン酸化によりDELLAやTPRとの結合が変化するかをin vitro の実験系を用いて検証する。
Ｈ26年度は、形質転換植物の作製、及び解析、植物培養細胞を用いたトランジェント解析によるGAF1複合体の転写活性化能の評価、変異タンパク質を用いた修飾部位の同定等の解析を行った。これらの研究手法は、DELLA-GAF1 の機能解析と並行して研究を行うことができたため、新たな研究試薬等をそれほど購入することなく研究が遂行できたため、消耗品費等を節約でき次年度にH26年度未使用分を使用することとした。
H27年度は、申請者は、大学院生とともに研究を進める。in vitro 系、または、in vivo系を用いて、GAF1の翻訳後修飾部位の同定を行う。この研究推進のために、変異タンパク質作成のための合成オリゴマーの作製、修飾部位を検出するモノクローナル抗体作製といった消耗品費に多くを投入する。また、修飾されたタンパク質を用いて、MALDI-Tof mas解析による修飾部位の同定にも使用する。H27年度は、修飾部位同定のために必要な試薬購入等で、消耗品費の支出が多く見込まれることから、H26年度の持ち越し分とH27年度の研究費の多くを消耗品費に使用する。また一部を学会等の出張費に使用予定である
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (3件)
Plant Signal and Behavior
巻: 9 ページ: e977721
10.4161/15592324.2014.977721
Plant Cell
巻: 26 ページ: 2920-2938
10.1105/tpc.114.125690
Plant Physiology
巻: 165 ページ: 1737-1750
10.1104/pp.114.236448
